王小琴， 石 卉， 方小霞， 彭聿平

(南通大学医学院生理学系， 江苏 南通 226001)

类风湿关节炎 (rheumatoid arthritis, RA) 是一种自身免疫性疾病，主要表现为关节软骨的破坏，关节血管翳的形成以及免疫细胞的浸润等关节炎症反应。RA的发病机制还不是很明确，但有研究提示CD4+T细胞在RA的发生发展过程中发挥着重要作用[1，2]。调节性T细胞 (regulatory T, Treg) 是CD4+T细胞的一个亚群[3]，主要分泌转化生长因子 (transforming growth factor, TGF)-β和IL-10，是体内具有免疫抑制功能的异质性细胞群，在维持外周免疫耐受中起重要作用，其数量减少或功能缺失可导致炎症和自身免疫性疾病的发生发展。

去甲肾上腺素 (norepinephrine, NE)是儿茶酚胺的一种，近年来发现儿茶酚胺可以调节机体的免疫功能。外周神经系统的交感神经纤维释放的神经递质是NE。有研究表明，交感神经释放的NE在浓度较高时具有抗炎作用[4,5]。在胶原诱导性关节炎 (collagen induced arthritis, CIA)早期，交感神经加重疾病症状，而疾病晚期，交感神经可改善关节炎症状[6,7]。CIA是当前研究RA较理想和最为常用的动物模型。阐明交感神经释放的神经递质NE对CIA小鼠模型中Treg细胞的作用可以更好地理解交感神经在RA中的作用，但NE对CIA小鼠模型中Treg细胞的作用还不是很清楚。有研究显示，NE 通过免疫细胞上的肾上腺素受体 (adrenoreceptor，AR) 调节免疫细胞的增殖、分化、凋亡和细胞因子的产生[8]。我们实验室以前的研究表明，T淋巴细胞可以表达α1-AR，儿茶酚胺可以通过激活α1-AR促进Th1细胞向Th2细胞方向分化[9]。本研究中，我们利用CIA模型小鼠，探讨NE及其α1-AR 对CIA小鼠Treg细胞的作用，希望可以为RA这一疾病提供新的治疗方案。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性SPF级DBA /1小鼠 (购于上海斯莱克实验动物有限公司) 32只，8～10 周龄，平均体质量为 (18±2) g，随机分为对照组 (n=8) 和CIA模型组 (n=24)。室内适应性喂养一周后用于实验。对照组安静饲养，CIA组进行模型制备。

1.2 试剂

鸡II型胶原 (collagen II，CII) 购于Sigma公司；佛氏完全佐剂 (complete freund’s adjuvant，CFA) 购于Chondrex公司；脂多糖 (lipopolysaccha-ride，LPS) 购于Sigma公司；小鼠CD4磁珠分选试剂盒，购自Miltenyi Biotec公司；TGF-β、IL-10、β-actin抗体均购于Santacruz公司；抗α1-AR、CD4抗体，购自Abcam公司；PE标记的抗CD25抗体、APC标记的抗Foxp3抗体均购于BD公司；α1-AR 激动剂苯肾上腺素 (phenylephrine)，购自Abcam公司。

1.3 CIA小鼠模型制备及模型成功制备的判定标准

第 0 日，在雄性DBA/J小鼠尾根部多点注射含有 100 μg CII的胶原乳剂100 μl，初次免疫后第 21 日，在小鼠腹腔注射相同的胶原乳剂 100 μl，初次免疫后第 28 日，在小鼠腹腔注射溶于 20 μl PBS的LPS 20 μg以加速关节炎的发生。从初次免疫后第21日开始，每隔2日对每只小鼠四个足爪进行评分直至观察的最后一天即初次免疫后第41日。评分标准[10]如下：0分：无红肿；1分：轻度的红和肿；2：显著的皮肤发红和关节肿胀；3分：关节僵硬，肢体活动受限。四只足爪均被评分，每只小鼠最高分为12分。评分者为与实验不相关的第三者。实验过程中应尽量保持实验条件 (测试者、测试时间、实验环境等) 的一致性，尽量减少实验的干扰因素。

1.4 CIA小鼠踝关节宽度和后足厚度的测量

在初次免疫后第 41 日，用千分尺测量小鼠踝关节宽度和后足厚度。测量者为与实验不相关的第三者。

1.5 ELISA法检测血清中抗 CII IgG 抗体水平

初次免疫后第 41 日，对小鼠进行麻醉、眼静脉取血，37℃ 静置 1 h，离心 (3 000 r/min, 15 min)，取血清，-20℃保存。CII 包被 96 孔 ELISA 培养板。根据文献[11]方法进行检测。

1.6 CD4+ T细胞磁珠分选及药物处理

在初次免疫后第 41 日，无菌取CIA小鼠脾脏，分离淋巴细胞。用CD4+T细胞磁珠分选出CD4+T细胞。得到的细胞按 1×107cells/ml 密度种于培养板中，加抗小鼠CD3、CD28单克隆抗体 (1 μg/ml) 置于 37℃，5% CO2，饱和湿度下培养 48 h，诱导CD4+T淋巴细胞增殖。将NE或α1-AR激动剂phenylephrine加入到活化的CD4+T细胞中，使其终浓度分别达到 10-5mol/L，继续培养24 h进行后续实验。

1.7 流式细胞术检测CD4+ T细胞中Treg细胞数目的变化

NE处理 24 h 后的CD4+T细胞中，加入PE标记的抗CD25抗体、APC标记的抗Foxp3抗体, 利用BD公司FACS Calibur流式细胞仪进行检测。

1.8 Western blot法检测蛋白表达

取CIA小鼠踝关节或脾脏或NE处理 24 h 后的CD4+T细胞，提取组织或细胞蛋白，进行蛋白浓度的测定，每孔上样量 100 μg，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酞胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 凝胶电泳，转膜。室温封闭 2 h 后孵抗TGF-β抗体 (1∶200)、抗IL-10抗体 (1∶200)、抗α1-AR抗体 (1∶200) 或抗β-actin抗体 (1∶5 000)，4℃包被过夜，荧光标记羊抗小鼠IgG (1∶5 000) 或荧光标记羊抗兔IgG (1∶5 000) 室温孵育 1 h 后Odyssey双红外激光扫描系统扫描并分析。

1.9 免疫荧光染色

初次免疫后第 41 日，取材固定对照和CIA小鼠脾脏切片 (25 μm)，加山羊血清封闭 30 min，加入抗CD4和抗α1-AR抗体，4℃孵育过夜，加入特异性标记的二抗，室温孵育 4 h，PBS漂洗，甘油封片, 荧光显微镜下观察。

1.10 统计学处理

2 结果

2.1 CIA小鼠的临床评分、踝关节宽度和后足厚度及血清中抗 CII IgG 抗体水平的变化

小鼠经 CII 免疫后第 31 日开始，开始出现多关节肿胀等关节炎表现，临床评分显著升高。对照组小鼠临床评分为0。与对照组相比，CIA 小鼠的踝关节宽度和后足厚度明显增加。CIA 小鼠血清中抗 CII IgG 抗体的水平明显高于对照组 (表1)。

Tab. 1 Clinical score, ankle joint and rear paw thickness and anti-CII IgG level in serum in CIA mice n=8)

2.2 NE对CIA小鼠CD4+ T细胞中Treg细胞功能的影响

为了说明NE对CIA小鼠CD4+T细胞亚群Treg细胞的作用，我们分离出CIA小鼠脾脏的淋巴细胞并分选活化CD4+T细胞，并在细胞中加入NE。首先用流式细胞术检测了CIA小鼠CD4+T细胞中Treg细胞数目的变化，CD25+Foxp3+细胞代表Treg细胞。结果显示，在CIA小鼠中，与未加药组相比，NE加入后的CD4+T细胞中CD25+Foxp3+(Treg) 细胞的百分比显著增加 (图1A，表2)。其次，我们检测了CIA小鼠CD4+T细胞中TGF-β和IL-10的蛋白表达水平的变化。结果显示，在CIA小鼠中，与未加药组相比，NE加入后的CD4+T细胞中TGF-β和IL-10的蛋白表达水平显著增加 (图1B，表2)。

Fig. 1 Effects of NE on Treg cell function in CD4+ T cells of CIA miceA: Representative fluorescent dot images showing Treg cells by flow cytometric analysis； B: Treg-specific cytokine protein expression in CD4+ T cells of CIA mice was assessed by Western blot analysis； CIA: Collagen-induced arthritis； NE: Norepinephrine

Tab. 2 Effects of NE on Treg cell number and TGF-β and IL-10 protein expressions in CD4+ T cells of CIA n=4)

2.3 CIA小鼠炎性组织中α1-AR表达的变化

为了说明CD4+T细胞能否表达α1-AR，我们用免疫荧光染色法检测对照组和CIA模型组脾脏中CD4与α1-AR表达的情况。结果显示，对照组和CIA模型组脾脏中均有CD4单阳性与α1-AR单阳性细胞的存在，且均有CD4与α1-AR共定位的双阳性细胞的存在，说明CD4+T细胞能够表达α1-AR (图2A)。进一步的实验中，我们检测了对照组和CIA模型组踝关节和脾脏中α1-AR的蛋白表达的变化。研究发现，与对照组相比，CIA小鼠踝关节和脾脏中α1-AR的蛋白表达显著降低 (图2B，表3)。

Fig. 2 α1-AR is expressed by CD4+ T cells and α1-AR protein expression in the ankle and spleenA: Immunofluorescence staining of the spleen sections. The arrows point to the typical cells of co-expressing CD4 and α1-AR (×40)； B: α1-AR protein expression in the ankle and spleen were assessed by Western blot analysis； CIA: Collagen-induced arthritis

Tab. 3 Quantitative analysis of α1-AR protein expressions in ankle joints and spleen of CIA mice n=4)

2.4 α1-AR激动剂对CIA小鼠CD4+ T细胞中Treg细胞功能的影响

为了说明α1-AR在CIA小鼠CD4+T细胞中的作用，我们将α1-AR激动剂phenylephrine加入CIA小鼠的CD4+T细胞中，并检测了TGF-β和IL-10的蛋白表达水平。结果发现，在CIA小鼠中，与未加药组相比，α1-AR激动剂phenylephrine加入后的CD4+T细胞中TGF-β和IL-10的表达水平显著增加 (图3，表4)。

Fig. 3 Effects of α1-AR agonist on Treg-specific cytokine expression in CD4+ T cellsCIA: Collagen-induced arthritis； Phen: Phenylephrine

Tab. 4 Quantitative analysis of TGF-β and IL-10 protein expressions in CD4+ T cells of CIA mice n=4)

3 讨论

本研究中，用CII免疫小鼠，关节出现红肿，小鼠四肢临床评分显著增加。CIA模型小鼠血清中抗CII-IgG抗体显著高于对照组。在RA早期患者血清中抗CII特异性抗体显著增加[12]。在一些CIA实验模型中也证实血清中抗CII特异性抗体的升高是关节炎性疾病的反应[5]。说明我们成功制备了CIA 小鼠模型。

在抗原刺激下，NE从交感神经末梢释放到淋巴组织中，对免疫细胞发挥作用。有研究表明，NE能够抑制树突状细胞或单核细胞中的致炎因子TNF，IL-1，IL-6 和 IL-12的产生，而增加抗炎因子IL-10的产生[13]。有研究报道，Treg细胞的缺失或者功能下调可以导致多种自身免疫性疾病的发生。Treg细胞通过产生的抗炎细胞因子TGF-β和IL-10抑制自身免疫的T细胞的损伤[14]，以达到控制自身免疫性疾病的进展、治疗患者的目的。此外，早期RA患者外周血中 Treg比率降低，经相关药物治疗后，外周血中Treg数量明显回升，其免疫抑制功能也得以恢复[15-17]。这些研究提示，Treg细胞在RA中发挥着抗炎作用。本研究中，我们发现CIA小鼠的CD4+T细胞经NE处理后，Treg细胞的百分比显著增加，TGF-β和IL-10的蛋白表达水平显著增加，提示NE可增强CIA小鼠CD4+T细胞中Treg细胞的功能，促进CIA 小鼠的CD4+T细胞向Treg细胞方向分化，进而说明NE在CIA小鼠中具有增强抗炎反应的作用。NE对免疫系统的影响主要通过ARs来实现的。既往研究表明，α1-AR介导了儿茶酚胺诱导的淋巴细胞凋亡和Th1细胞向Th2细胞方向的分化[9,18]。这些研究提示，α1-AR在介导NE的免疫调节功能中发挥着重要作用。有文献报道，在RA中，交感神经系统通过α1-AR的活化来调节免疫细胞的功能[19]。本研究中，我们发现对照组和CIA组小鼠脾脏中均有CD4与α1-AR共定位的双阳性细胞的存在，说明CD4+T细胞能够表达α1-AR。此外，CIA小鼠踝关节和脾脏中α1-AR的蛋白表达显著降低，提示α1-AR参与了CIA的免疫应答。进一步的研究发现α1-AR激动剂phenylephrine显著增加CIA小鼠CD4+T细胞中TGF-β和IL-10的蛋白表达水平，提示激活CIA小鼠CD4+T细胞上α1-AR可增强CD4+T细胞中Treg细胞的功能，促进CD4+T细胞向Treg细胞方向分化。以上结果提示，NE可通过激活CIA小鼠CD4+T细胞上的α1-AR，促进CD4+T细胞朝向Treg细胞分化，但具体的作用机制还需要通过深入的实验来探讨。

综上所述，CIA 小鼠临床评分、踝关节宽度和后足厚度及血清中抗 CII IgG 抗体水平升高。CIA小鼠α1-AR的表达水平显著降低；NE可通过激活CIA小鼠CD4+T细胞上的α1-AR增强CIA小鼠CD4+T细胞中Treg细胞的功能，促进CD4+T细胞朝向Treg细胞分化，从而发挥抗炎作用。上述研究，可为RA的治疗方案提供一定的研究空间。