牛 玲 ，李博一 ，张 程 ，马 蓉 ，唐 艳 ，刘 方 ，尹利民 ，韩竺君 ，苗翠娟 ，张 娴

（1）昆明市第一人民医院内分泌科；2）检验科，云南 昆明 650011）

2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）患者易同时合并骨质疏松症（osteoporosis，OP）。由于骨质疏松导致的骨折和骨折致残严重影响患者生活，同时给家庭、社会带来沉重经济负担。因此重视防治糖尿病性骨质疏松对于糖尿病患者的生活质量改善具有重要意义。遗传是T2DM 和OP 重要的发病因素，有研究认为糖尿病性骨质疏松是一种多基因遗传病，这些基因[1]包括降钙素受体（calcitonin receptor，CTR）基因、维生素D 受体（vitamin dreceptor，VDR）基因及护骨素基因等.对糖尿病性骨质疏松的单一基因研究较多，但不同基因间的联合研究较少，而且结论不一。本研究旨在探讨CTR 联合VDR 基因多态性与昆明地区T2DM 伴骨质疏松症的关系，以期为昆明地区T2DM 伴骨质疏松症的防治提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象

随机抽样选取2017 年6 月至2019 年1 月在昆明市第一人民医院内分泌科住院治疗的2 型糖尿病患者237 例，其中男性122 例，女性115 例，年龄50～84 岁，平均（64.68±7.92）岁。2 型糖尿病诊断标准采用2013 年版《中国2 型糖尿病防治指南》标准诊断糖尿病[2]。骨质疏松症诊断标准采用2011 年版《原发性骨质疏松症诊治指南》标准诊断[3]，按T 值评分诊断骨质疏松。所有入选的2 型糖尿病患者在昆明地区居住时间均大于10 a。排除标准：（1）1 型糖尿病，继发性糖尿病；（2）各种糖尿病急性并发症、伴有感染、营养不良、严重心脑及肝肾疾病、肿瘤患者；（3）皮肤疾病无法接受阳光照射者；（4）甲状腺手术史，合并其他可能引起甲状腺激素代谢异常的其他内分泌、免疫系统疾病、结缔组织病者，如垂体瘤、垂体功能减退者，亚急性甲状腺炎等；（5）存在类风湿或风湿或关节炎，且应用激素类药物时间超过6 个月，或曾经接受活性维生素D、降钙素、雌激素受体调节剂等影响骨代谢的药物治疗者；（6）存在畸形性骨关节炎者和成骨不全患者。纳入的研究对象均签署知情同意书，且本研究经昆明市第一人民医院医学伦理学委员会批准。

1.2 分组

（1）将237 例患者按骨密度检测结果分为糖尿病无骨质疏松症61 例；糖尿病合并骨量减少111 例；糖尿病伴骨质疏松65 例。

（2）将237 例患者按CTR 及VDR 基因型进行组合，共有6 种类型，分别为CCBB 型28 例，CCBb 型142 例，CCbb 型11 例，CTBB 型3 例，CTBb 型42 例，CTbb 型11 例，随后经卡方检验，据检验结果进行合并，最后分为三种组合型：CC+BB 型28 例，CC+Bb、bb 型153 例，CT+BB、Bb、bb 型56 例。

1.3 研究方法

1.3.1 一般指标记录年龄、性别、糖尿病病程，男性是否吸烟，男性是否饮酒。测试当日由专人用固定体重/身高测量仪测定：体重、身高、计算体重指数（BMI），单位kg/m2。

1.3.2 血压指标采用汞柱式标准袖带血压表，受试者入院时休息5 min 后测定坐位右上臂收缩压（SBP）/舒张压（DBP），单位mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）。

1.3.3 其他生化指标受试者隔夜禁食8～12 h，入院第二天清晨6 点30 分-8 点取静脉血测空腹血糖（FPG）、糖化血红蛋白（HbA1c）、肝肾功能电解质（血钙）、血脂、尿酸（UA）、维生素D 浓度、雌激素水平、睾酮水平，超敏C 反应蛋白（Hs-CRP）、纤维蛋白原（FIB）。按标准方法行OGTT试验，检测OGTT-0h、2 h 血糖，采用化学发光法测定0 h、2 h 胰岛素（INS）水平（单位：mIU/L）。再采用稳态模型评估胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）：HOMA-IR=FINS X FPG/22.5，FINS 单位为mIU/L，FPG 即OGTT-0 h，单位为mmol/L。低的HOMAIR 示高胰岛素敏感性，而高的HOMA-IR 表示胰岛素敏感性差，存在胰岛素抵抗。

1.3.4 外周血基因组DNA 提取空腹采集静脉血6～8 mL，EDTA 抗凝，-80 ℃保存，标本收集结束后购进DNA 提取试剂盒统一提取CTR、VDR 基因。所需试剂及仪器为：DNA 提取试剂盒，购于AXYGEN 公司；DNA 聚合酶（2×Taq Master Mix）购于Bioteke 公司，引物由昆明硕擎公司合成；普通PCR 仪购于美国应用生物系统公司（型号ABI2720）；各种规格的离心管、枪尖、PCR 管、一次性乳胶手套和口罩购于NSET 公司。

1.3.5 PCR 扩增（1）PCR 基因扩增所使用的引物，见表1；（2）PCR 反应体系：25 µL 混匀液体。包括2XTaq PCR Master Mix 12.5 µL，PCR Forward Primer（10 µM，硕擎）1 µL，PCR Reverse Primer（10 µM，硕 擎）1 µL，Template DNA 4 µL，Nuclease-freeWater 8.5 µL；（3）PCR 反应条件：共35 个循环，95 ℃预变性5 min，然后95 ℃变性30 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸60 s，反应完成后，72 ℃再延伸10 min；（4）酶切鉴定基因型：CTR 基因的PCR 扩增产物用AluⅠ内切酶酶切后，VDR 基因的PCR 扩增产物用BsmⅠ酶酶切后，置于2%琼脂糖凝胶电泳确定基因型。

表1 PCR 扩增所使用的引物Tab.1 The primer PCR amplification

1.3.6 骨密度测量采用通用电气医疗系统（中国）有限公司生产的双能X 线骨密度仪（型号DPX Bravo）测量腰椎L1-L4、股骨颈、髋部骨密度及T 值评分（BMD），单位g/cm2。

1.4 统计学处理

所有数据均使用SPSS11.5 软件包进行统计处理。采用Hardy-Weinberg 平衡检测基因型的分布是否具有代表性。正态分布计量资料用均数±标准差（）表示，3 个独立样本比较，采用方差分析，组间比较用最小有意义差异法（LSD 检验）。非正态分布计量资料用M（P25，P75）表示，采用秩和检验。计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验。采用多因素Logistic 回归分析筛选独立危险因素，P<0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 3 组人群一般资料比较

3 组人群一般资料总体比较，结果显示：性别、年龄、吸烟、饮酒、DBP、身高、体重、BMI、HDL-C、雌激素、睾酮差异均有统计学意义（P<0.05）。且在两两比较时，T2DM 伴骨质疏松组与无骨质疏松组比较，上述指标均有统计学差异（P<0.017），见表2。

表2 研究对象的一般资料比较 [/M（P25，P75）]Tab.2 Comparison of general data of study objects [/M（P25，P75）]

表2 研究对象的一般资料比较 [/M（P25，P75）]Tab.2 Comparison of general data of study objects [/M（P25，P75）]

*P <0.05。

2.2 CTR 及VDR 基因型

2.2.1 CTR 基因型酶切电泳图结果显示：CTR基因AluI 酶切位点多态性确定为：纯合子CC 型228 bp 一条带 ；杂合子CT 型228 bp 和120 bp两条带；纯合子 TT 型120 bp 一条带，见图1。

图1 CTR 基因型酶切电泳图Fig.1 CTR genotypes enzyme electrophoresis figure

2.2.2 VDR 基因型酶切电泳图结果显示：VDR基因Bsm I 酶切位点多态性确定为:纯合子BB 型825 bp 一条带 ；杂合子Bb 型825 bp、675 bp、150 bp 三条带；纯合子bb 型675 bp、150 bp 两条带，见图2。

图2 VDR 基因型酶切电泳图Fig.2 VDR genotypes enzyme electrophoresis figure

2.2.3 CTR 联合VDR 基因型分布情况CTR、VDR 基因型分布符合Hardy-Weinberg 平衡定律，说明所选人群代表性好。在237 例人群中，CTR联合VDR 基因型分布情况为：以CCBb 型为主（142 例、占60.0%），其次为CCBB 型28 例（11.8%），CCbb 型11 例（4.6%），CTBB 型3 例（1.3%），CTBb 型42 例（17.7%），CTbb 型11 例（4.6%）。随后按2 型糖尿病无骨质疏松症组，合并骨量减少组，骨质疏松组分3 组，6 个基因组合经卡方检验，据检验结果进行合并，最后分为三种组合型：CC+BB 型28 例，CC+Bb、bb 型153 例，CT+BB、Bb、bb 型56 例。

2.2.4 3 组人群CTR 联合VDR 基因型组合比较结果显示：3 组人群VDR 联合CTR 基因型组合CCBB 型，CC+Bb、bb 型，CT+BB、Bb、bb 型比较，无统计学差异（χ2=1.604，P=0.808），见表3。

表3 CTR 联合VDR 基因型分布频率比较[n（%）]Tab.3 CTR system joint VDR genotypes distribution frequency comparison [n（%）]

2.3 CTR 联合VDR 基因型组合与2 型糖尿病患者BMD 的关系

结果显示：237 例T2DM 患者中，VDR 联合CTR 的不同基因型组合在各部位的BMD 值差异均无统计学意义（P>0.05），见表4。

表4 VDR 联合CTR 基因多态性与2 型糖尿病患者BMD 的关系（g/cm2）（）Tab.4 The relationship between the CTR system joint VDR gene polymorphism and BMD of T2DM patients（g/cm2）（）

表4 VDR 联合CTR 基因多态性与2 型糖尿病患者BMD 的关系（g/cm2）（）Tab.4 The relationship between the CTR system joint VDR gene polymorphism and BMD of T2DM patients（g/cm2）（）

2.4 多因素Logistic 回归分析结果

将VDR 及CTR 基因型组合（1 为CCBB 型，2 为CC+Bb、bb 型，3 为CT+BB、Bb、bb 型）及单因素分析3 组间具有统计学差异的变量，即性别（0 为女，1 为男）、年龄、吸烟（0 为无，1 为有）、饮酒（0 为无，1 为有）、DBP、身高、体重、BMI、HDL-C、雌激素、睾酮作为自变量，糖尿病有无骨质疏松作为因变量（0 为无，1 为有），进行多因素Logistic 回归分析，以筛选糖尿病伴骨质疏松的独立危险因素。结果显示：仅年龄（OR1.089、98%CI：1.033～1.148、P=0.002）、可以进入回归方程，见表5。

表5 Logistic 回归分析结果Tab.5 Logistic analysis results

3 讨论

国内有报道[4]，近1/3 的糖尿病患者同时合并骨质疏松症。然而，T2DM 伴骨质疏松症的发病机制非常复杂，糖尿病高血糖状态、糖基化终末产物（AGEs）、糖尿病慢性并发症、氧化应激损伤、炎症因子（CRP、IL-6 等）水平的升高、胰岛素及胰岛素样生长因子分泌的减少等均可能影响骨代谢[5−7]。另外，年龄、性别、生活方式、体重、吸烟、营养状态、环境和遗传等均是重要的影响因素。目前，对于单个基因与2 型糖尿病伴骨质疏松症的研究，国内外已有不少报道，但CTR 联合VDR 基因多态性与2 型糖尿病伴骨质疏松症的研究报道较少。

降钙素（ealeitonin，CT）是甲状腺滤泡旁细胞分泌的多肽激素[8]，它能增强肾脏排泄钙的能力，抑制破骨细胞的骨再吸收作用[9]。CTR 位于破骨细胞膜，分子量为89 kD，包含490 个氨基酸，现已证明氨基端功能区的e2 区是降钙素结合位点。CTR 基因位于染色体7q21.3 上，CTR 基因的多态性是其核苷酸序列1377 处的C 突变为T，导致相应的蛋白结构中第463 氨基酸脯氨酸（CCG）突变为亮氨酸（CTG），从而使CTR 基因产生CC（纯脯氨酸）、TT（纯亮氨酸）、TC（脯氨酸、亮氨酸杂交型）3 种基因型[10]。

维生素D 是一组脂溶性类固醇衍生物，可以调节免疫反应、促进胰岛素合成及分泌、增加胰岛素敏感性。微生素D 在人体内没有生物活性，临床上往往通过检测循环中的25（OH）D3 来反映人体内维生素D 的水平。VDR 属类固醇激素/甲状腺激素受体超家族，广泛存在于30 多种组织中[11]。维生素D 受体基因位于12 号染色体长臂q12-14，长约75 kD，是甾体类受体家族中的一员，由9 个外显子和8 个内含子组成。对于VDR基因多态性，目前主要研究包括Fok I（rs2228570）、Bsm I（rsl544410）、Apa I（rs7975232）、Taq I（rs731236）4 种，Fok I 位于编码区，控制VDR 蛋白生成；Bsm I、Apa I、Taq I 位于基因3′端，可能与多聚腺苷酸复制及VDR mRNA 稳定性有关。本研究选取Bsm I 酶切位点。

本研究结果显示：从无骨质疏松症组-骨量减少组-骨质疏松症组，身高、体重、BMI 逐渐下降；女性占比则增多，分别是15 例（24.6%），50 例（45%），50 例（76.9%）；男性吸烟占比也增大，分别是24 例（52.2%），32 例（52.5%），11 例（73.3%）；提示体重可能是2 型糖尿病患者骨质疏松的保护性因素，而女性2 型糖尿病患者更易患骨质疏松，吸烟可能是2 型糖尿病患者骨质疏松的危险因素。但进一步Logstic 回归分析显示：身高、体重、BMI、性别、吸烟均未进入回归方程，尚不能说明体重、性别、吸烟是昆明地区T2DM伴骨质疏松的症的独立危险因素。

从无骨质疏松组-骨量减少组-骨质疏松症组，年龄逐渐增加，进一步Logstic 回归分析显示：年龄可进入回归方程，说明年龄是昆明地区T2DM伴骨质疏松症的独立危险因素。与国内曹国磊[12]的研究结果一致。随年龄增长，人体骨量在变化，30～40 岁时骨量积累达峰值，以后逐渐下降。Jonsson 等[13]发现：70 岁女性髋部骨折几率是女轻女性的5 倍。所以，应做好70 岁以上老年人骨质疏松的防治工作。

在2 型糖尿病患者中，无骨质疏松组，骨量减少组，骨质疏松组3 组比较，CTR-VDR 基因型组合后分布频率无统计学差异。进一步按CTRVDR 分组发现：三种组合的基因型患者，不同部位骨密度比较也无统计学差异。孟德峰[14]对新疆汉族女性的研究也发现：在骨质疏松组患者中，CTR-VDR 复合基因型与各部位骨密度无关。

综上所述，T2DM 伴骨质疏松症的影响因素及候选基因较多，笔者的研究发现，年龄是T2DM 伴骨质疏松症的独立危险因素，但未发现CTR-VDR 复合基因型与昆明地区 T2DM 伴骨质疏松症的遗传易感性有关。有待进行更加深入、广泛、大样本、多地域、多种族、多个基因的联合研究，以期为2 型糖尿病骨质疏松的防治工作提供更多的有用信息和依据。