王晓珍，刘 录，吴安超，王钺涵，周志宏，杨竹雅

（云南中医药大学云南省高校中药饮片工程研究中心，云南 昆明 650500）

头顶一颗珠，为百合科（Liliaceae）延龄草属（Trillium L.）多年生草本植物延龄草（Trillium tschonoskiiMaxim.）的干燥根茎，又名芋儿七、佛手七等，是土家族民族民间习用四大神药之一。该药性温，味甘、微辛，有小毒，具有镇静、止痛、活血、止血的功效，主要用于治疗眩晕头痛、神经衰弱、腰腿疼痛、月经不调等病症[1]。

目前从头顶一颗珠中分离得到的化合物约90 个，以甾体皂苷为主，包括延龄草皂苷、偏诺皂苷、薯蓣皂苷和克里托皂苷等，此外还含有黄酮苷、倍半萜苷、苯丙素苷、多糖等[2]。现代研究表明头顶一颗珠具有镇痛、抗炎、抗肿瘤、增强心脏功能和免疫调节等作用[3−8]。

作者对云南产头顶一颗珠化学成分研究表明，其富含偏诺皂苷元类型甾体皂苷，此类皂苷具有止血及收缩子宫平滑肌作用，但未见相关文献报道。云南部分彝族地区民间医生使用本品治疗产后出血。本文报道头顶一颗珠对子宫平滑肌的收缩作用，并对其活性部位进行初步化学成分分析，为充分开发利用头顶一颗珠提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 仪器BL-420F 型生物机能实验系统（成都泰盟科技有限公司），SQG-4 型四腔器官浴槽系统（成都仪器厂），HH-S25 型数显恒温水浴锅（金坛市大地自动化仪器厂），AB204-S 型电子分析天平（瑞士Mettlertoledo 公司），BS110S 型赛多利斯电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）。Bruker AM-400AM-500 Spectrometer 核磁共振仪，VG Autospec 3000 system spectrometer 质谱仪。薄层硅胶G 和色谱柱硅胶（青岛海洋化工厂），Sephadex LH-20（GE Healthcare 公司），MCI（日本三菱公司）。

1.1.2 试剂宫血宁胶囊（云南白药集团股份有限公司，规格0.13 g/每粒，产品批号ZMA1402），己烯雌酚（天津金耀氨基酸有限公司，规格1 mL：0.5 mg，批号0204281）。试剂均为化学纯。

1.1.3 动物健 康成年雌性未孕SD 大鼠46 只，体重200～230 g，昆明楚商科技有限公司提供。

1.1.4 材料试验用药材样品于2018 年9 月采自云南华坪县（栽培品），由云南省药物研究所赵仁主任药师鉴定为百合科延龄草属植物延龄草Trillium tschonoskiiMaxin 的干燥根茎。

1.2 方法

1.2.1 头顶一颗珠样品制备取2 kg 干燥延龄草，经适当粉碎，用10 倍量70%乙醇冷浸提取5 次，36、24、24、12、12 h/次，合并提取液，减压回流得总浸膏；浸膏加水10 L，搅拌，静置，过滤，沉淀用5 L 水洗涤，干燥，得沉淀70.5 g（F0）；洗涤液与滤液合并，经大孔吸附树脂层析，以乙醇-水（0∶100～40∶60）梯度洗脱，浓缩得F1～F5段，以乙醇-水（70∶30）梯度洗脱，浓缩得F6段。

1.2.2 动物分组46 只雌性大鼠随机分为7 组，每组至少6 只，分别为：阳性组（宫血宁胶囊）、F1～F6组。

1.2.3 正常大鼠离体子宫平滑肌条的制备[9−10]试验前2 d 取大鼠，腹腔注射己烯雌酚0.1 mg/kg 一次，复制动情期大鼠模型。试验时，颈椎脱臼处死大鼠，剖腹取出子宫，立即置于盛有任-洛氏液（取NaCl 9.0 g、KCl 0.42 g、CaCl20.24 g、NaHCO30.15 g、葡萄糖1.0 g，用生理盐水制备成1 000 mL 的溶液，即得）的玻璃培养皿中，通氧。小心剥离附于子宫壁上的结缔组织和脂肪组织，将两侧子宫平滑肌剪成长度1 cm 的小段，备用。每段子宫肌条的两端分别用线结扎，一端固定于放入通有氧气（速度为1～2 个气泡/s）盛有任-洛氏液20 mL 的浴槽中，保持浴槽中的营养液温度为（37±0.5）℃，另一端与张力传感器相连。离体子宫平滑肌条静息后，调节负重1 g，平衡30 min，待子宫平滑肌条收缩平稳后开始试验。

1.2.4 延龄草不同馏分对离体子宫平滑肌条的影响记录子宫平滑肌正常曲线，而后按浓度梯度依次向浴槽中分别累积加入阳性药物（宫血宁胶囊）和F1～F6各馏分组，使终浓度为：1×10-7g/mL、3×10-7g/mL、1×10-6g/mL、3×10-6g/mL、1×10-5g/mL、3×10-5g/mL、1×10-4g/mL，制作累积曲线。每次加入受试药物后，观察10 min 内子宫平滑肌的收缩情况，之后用任-洛氏液冲洗3 次，稳定10 min 后加入另一受试药物进行观察。给药后，观察离体子宫平滑肌的收缩频率（次/10 min）；收缩强度，以每次收缩所达到的最高点（g）表示的变化；收缩活动力（收缩强度×收缩频率）。试验重复6 次。

1.2.5 头顶一颗珠活性部位化学成分分离F6段用经硅胶柱色谱，以三氯甲烷-甲醇（7∶1-1∶1）为溶剂洗脱，经硅胶柱色谱（三氯甲烷-丙酮）、MCI（水-甲醇）和Sephadex LH-20（甲醇）反复纯化得化合物1（0.2 g）、2（0.3 g）和化合物3（0.4 g）。

1.3 统计学处理

采用GraphPad Prism 5 统计分析软件进行数据处理。计量资料以（）表示，组间比较采用t检验，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 受试药对大鼠离体子宫收缩频率（次/10 min）的影响

受试药F2～F5在所试验的浓度范围内对大鼠离体子宫平滑肌收缩频率无影响（P>0.05）。F6在浓度1×10-5g/mL、3×10-5g/mL、1×10-4g/mL 时，与给药前相比，均能显著增加大鼠离体子宫平滑肌收缩频率（P<0.05）。阳性药物宫血宁胶囊的浓度在3×10-5g/mL、1×10-4g/mL 时，能显著增加大鼠离体子宫平滑肌收缩频率（P<0.05）。此外F1在3×10-5g/mL 和1×10-4g/mL 浓度梯度下能够显著降低大鼠离体子宫平滑肌收缩频率（P<0.05），见表1。

表1 受试药对大鼠离体子宫收缩频率（次/10 min）的影响（）Tab.1 The effect of the medicine on the frequency of isolated rat uterine contractions（times/10 min）（）

表1 受试药对大鼠离体子宫收缩频率（次/10 min）的影响（）Tab.1 The effect of the medicine on the frequency of isolated rat uterine contractions（times/10 min）（）

与给药前相比，△P <0.05，*P <0.01。

2.2 受试药对大鼠离体子宫收缩强度（g）的影响

F6浓度增加到1×10-4g/mL 时，与给药前相比，能够显著增加大鼠离体子宫平滑肌收缩强度（P<0.05），表明该部位为延龄草影响大鼠离体子宫收缩强度的主要活性部位。阳性药物宫血宁胶囊的浓度在1×10-4g/mL 时，能显著增加大鼠离体子宫平滑肌收缩频率（P<0.05）。此外，受试药F4在3×10-5g/mL、1×10-4g/mL 时表现为降低大鼠离体子宫平滑肌收缩频率（P<0.05），见表2。

表2 受试药对大鼠离体子宫平滑肌收缩强度（g）的影响（）Tab.2 The effect of the medicine on the contraction strength（g）of rat uterine smooth muscle in vitro（）

与给药前相比，△P <0.05，*P <0.01。

2.3 受试药对大鼠离体子宫平滑肌活动力的影响

F6浓度增加到1×10-5g/mL、3×10-5g/mL、1×10-4g/mL 时，与给药前相比，能够显著增加大鼠离体子宫平滑肌活动力（P<0.05），表明该部位为延龄草影响大鼠离体子宫收缩活动力的主要活性部位。阳性药物宫血宁胶囊的浓度在3×10-5g/mL、1×10-4g/mL 时，能显著增加大鼠离体子宫平滑肌活动力（P<0.05）。而受试药F1在1×10-4g/mL 时表现出降低大鼠离体子宫平滑肌活动力（P<0.05），见表3。

表3 受试药对大鼠离体子宫平滑肌活动力的影响（）Tab.3 The effect of the medicine on the motility of isolated rat uterine smooth muscle（）

表3 受试药对大鼠离体子宫平滑肌活动力的影响（）Tab.3 The effect of the medicine on the motility of isolated rat uterine smooth muscle（）

与给药前相比，△P<0.05，*P<0.01。

2.4 延龄草活性部位F6 化学成分分析

采用薄层色谱法，以乙酸乙酯-丙酮-水（3∶2∶0.4）为展开剂，10%硫酸乙醇为显色剂，显示F0和F6成分基本一致，有三个主要成分，且这三个主要成分在F1-F5中均未检出。通过对F6馏分进行化学成分分离，得到这三个主要成分，经波谱解析，化合物数据如下：

化合物1：白色针晶。1H-NMR（C5D5N，500 MHz）δ：0.67（3H，d，J=5.8 Hz，H-27），0.93（3H，s，H-18），1.08（3H，s，H-19），1.22（3H，d，J=7.2 Hz，H-21），5.26（1H，brd，J=5.0 Hz，H-6），1.76（3H，d，J=6.2 Hz，2'-ORha-H-6），4.98（1H，brd，Glc-H-1），6.37（1H，brd，2'-O-Rha-H-1）。13C-NMR（C5D5N，125 MHz）δ：37.6（C-1），30.5（C-2），78.3（C-3），39.0（C-4），140.9（C-5），121.8（C-6），32.5（C-7），32.4（C-8），50.3（C-9），37.2（C-10），21.0（C-11），31.9（C-12），45.2（C-13），53.1（C-14），32.1（C-15），90.0（C-16），90.2（C-17），17.2（C-18），19.5（C-19），44.8（C-20），9.8（C-21），109.9（C-22），31.9（C-23），28.8（C-24），30.2（C-25），66.7（C-26），17.4（C-27）；3-O-Glc：100.3（C-1），79.7（C-2），78.3（C-3），71.8（C-4），78.3（C-5），62.7（C-6）；2'-O-Rha：102.1（C-1），72.9（C-2），72.6（C-3），74.2（C-4），69.5（C-5），18.7（C-6）。以上数据与文献[11]报道基本一致，化合物1 鉴定为（25S）-偏诺皂苷元-3-α-L-吡喃鼠李糖基-（1→2）]-O-β-D-葡萄糖苷。

化合物2：白色针晶。1H-NMR（C5D5N，500 MHz）δ：0.68（3H，d，J=5.4 Hz，H-27），0.95（3H，s，H-18），1.07（3H，s，H-19），1.22（3H，d，J=7.2 Hz，H-21），5.29（1H，brd，J=3.8 Hz，H-6），1.58（3H，d，J=5.6 Hz，4''-ORha-H-6）1.75（3H，d，J=6.2 Hz，2'-O-Rha-H-6），1.61（3H，d，J=6.5 Hz，4'-O-Rha-H-6），4.84（1H，brd，Glc-H-1），5.82（1H，brd，2'-ORha-H-1），6.38（1H，brd，4'-O-Rha-H-1），7.05（1H，brd，4''-O-Rha-H-1）。13C-NMR（C5D5N，125 MHz）δ：37.6（C-1），30.0（C-2），78.3（C-3），38.6（C-4），139.9（C-5），121.8（C-6），32.4（C-7），32.2（C-8），50.8（C-9），37.4（C-10），21.9（C-11），30.8（C-12），45.2（C-13），51.6（C-14），31.4（C-15），90.0（C-16），90.1（C-17），16.7（C-18），18.1（C-19），44.8（C-20），9.9（C-21），109.8（C-22），31.4（C-23），28.1（C-24），30.0（C-25），66.8（C-26），17.0（C-27）；3-O-Glc：100.6（C-1），80.8（C-2），77.2（C-3），78.1（C-4），78.1（C-5），61.6（C-6）；2'-O-Rha：102.7（C-1），73.2（C-2），73.3（C-3），74.4（C-4），70.6（C-5），18.9（C-6）；4'-O-Rha：103.7（C-1），73.8（C-2），73.3（C-3），74.1（C-4），69.0（C-5），19.3（C-6）；4''-O-Rha：102.7（C-1），73.2（C-2），73.3（C-3），74.4（C-4），70.5（C-5），18.9（C-6）。以上数据与文献[12−13]报道基本一致，化合物2 鉴定为偏诺皂苷元-3-Oα-L-吡喃鼠李糖基-（1→4）-O-α-L-吡喃鼠李糖基-[O-α-L-吡喃鼠李糖基-（1→2）]-O-β-D-葡萄糖苷。

化合物3：白色针晶。1H-NMR（C5D5N，500 MHz）δ：0.67（3H，d，J=5.3 Hz，H-27），0.95（3H，s，H-18），1.07（3H，s，H-19），1.22（3H，d，J=7.2 Hz，H-21），5.28（1H，brd，J=4.2 Hz，H-6），1.75（3H，d，J=6.1 Hz，2'-ORha-H-6），1.62（3H，d，J=6.1 Hz，4'-O-Rha-H-6），4.82（1H，brd，Glc-H-1），5.85（1H，brd，2'-O-Rha-H-1），6.39（1H，brd，4'-O-Rha-H-1）。13C-NMR（C5D5N，125 MHz）δ：37.6（C-1），30.2（C-2），78.0（C-3），39.0（C-4），140.8（C-5），121.9（C-6），32.5（C-7），32.4（C-8），50.3（C-9），37.2（C-10），21.0（C-11），31.9（C-12），45.2（C-13），53.1（C-14），31.9（C-15），90.1（C-16），90.2（C-17），17.2（C-18），18.6（C-19），44.8（C-20），9.8（C-21），109.9（C-22），32.1（C-23），28.8（C-24），30.5（C-25），66.7（C-26），17.4（C-27）；3-O-Glc：100.3（C-1），78.6（C-2），78.1（C-3），78.0（C-4），77.8（C-5），61.3（C-6）；2'-ORha：102.1（C-1），72.9（C-2），72.8（C-3），74.0（C-4），69.6（C-5），18.7（C-6）；4'-O-Rha：102.9（C-1），72.9（C-2），72.8（C-3），74.2（C-4），70.4（C-5），19.5（C-6）。以上数据与文献[11]报道基本一致，化合物3 鉴定为偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-（1→4）-[O-α-L-吡喃鼠李糖基-（1→2）]-O-β-D-葡萄糖苷。

3 讨论

重楼甾体皂苷为妇科常用药宫血宁胶囊的主要成分。研究表明，重楼甾体皂苷具有缩宫止血的药效，不仅能通过引起子宫收缩而止血，并且能有效防止子宫强烈收缩而引起的子宫破裂[14]，因此，本研究采用宫血宁胶囊作为阳性药，在部分给药剂量中显示出作用活性，表明本实验体系可反映药物对大鼠子宫平滑肌的作用。

有研究报道，表现出较强缩宫活性的甾体皂苷具有以下特点：F 环闭合（螺甾类化合物）；羟基仅一个，位于7 号位（符合偏诺皂苷类单体的特征）；糖链上2 号位连有鼠李糖，侧链糖链越多缩宫作用越强[15]。但重楼甾体皂苷中偏诺皂苷含量并不高，同时，重楼因生长周期长，资源量小，使用成本高等问题严重制约了宫血宁胶囊市场应用及推广。

头顶一颗珠具有镇静、止痛、活血、止血的功效，云南民族民间亦有用于产后出血治疗，但未见现代研究报道。本研究采用大鼠离体子宫平滑肌试验方法，首次对头顶一颗珠分离后的不同馏分进行活性筛选。通过研究发现，其70%乙醇洗脱部位能显著增强离体大鼠子宫平滑肌的收缩频率、收缩强度和收缩活力。通过对该活性部位的主要化学成分分离鉴定，明确其主要物质基础为3 种偏诺皂苷，符合表现强缩宫活性的甾体皂苷化合物的结构特征，为头顶一颗珠进一步的开发利用奠定了基础。

头顶一颗珠富含具有缩宫作用的偏诺皂苷类成分，考虑到重楼资源的稀缺性和栽培的难度[16]，开发头顶一颗珠用于缩宫止血药更有效和经济，但其成药性还需要进一步研究和探索。