王晨豫，胡馨匀，魏 勇，陈 杰，曹梦园，陈明杰，齐亚银＊

1 石河子大学动物科技学院，新疆石河子 832003

2 新疆天润乳业股份有限公司，新疆乌鲁木齐 830000

0 引言

犊牛腹泻是规模化牧场常见症状，引起症状的原因复杂，主要集中在3月龄内，致死率高。新疆昼夜温差大，而且养殖水平相对落后，大部分牧场没有犊牛岛，在养殖生产上一旦控制不当，易造成较大的经济损失。犊牛免疫力较弱，对外界环境抵抗力较差，极易出现腹泻，病程为5～7天，会逐渐消磨犊牛的生命力，最后导致其脱水死亡。

造成犊牛腹泻的主要因素有以下几个方面。一是病毒因素，主要由轮状病毒、冠状病毒和牛病毒性腹泻病毒（Bovine Viral Diarrhea Virus，BVDV）引发。病毒引起犊牛腹泻无明显季节性，主要以地方性流行。当饲养密度过大，环境中悬浮颗粒较多，潮湿均有利于病毒传播。通常由妊娠期母牛垂直传播给犊牛或犊牛对外界抵抗力较弱而被感染。二是细菌因素，主要是由于犊牛生存在卫生条件差、易滋生细菌和病毒的环境下而感染大肠杆菌和沙门氏菌引发。三是寄生虫因素。主要由以隐孢子虫和贾第鞭毛虫为代表的寄生虫引发，且不容易被发现，往往通过母牛传染给犊牛。四是饲养因素，主要由饲养人员在哺乳期母牛饲料调控工作方面出现差错而引发。此外，犊牛缺乏营养也常会出现腹泻的情况[1，2]。

本文通过对新疆某规模化牧场腹泻犊牛粪便及血液进行检测，查明该牧场犊牛腹泻的病因，为该牧场的后续治疗和防控提供了科学依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

BVDV酶联免疫吸附剂测定（ELISA）抗原检测试剂盒购自IDEXX公司；PrimeScript™ RT Master Mix购自TaKaRa公司；普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、TIANamp Virus RNA Kit购自天根生化科技（北京）有限公司；2×Taq Plus Master Mix Ⅱ购自南京诺唯赞生物科技有限公司；RNA专用氯仿、RNA专用75.00%乙醇、异丙醇等购自生工生物（上海）有限公司。犊牛腹泻4联抗原快速检测试剂盒购自yoyoung公司。

1.2 样品来源

2020年12月采集新疆奎屯地区某牧场48 份3月龄内犊牛粪便及血液，血液置于采血器中析出血清，分装在1.5 mL离心管中放于-20 ℃保存。粪便样品置于5 mL离心管中，4 ℃保存，运输回实验室，立即进行细菌试验。试验后粪便样品转至-80 ℃长期保存。

1.3 犊牛腹泻4 联抗原快速检测

用棉签蘸取粪便，插入样品稀释管中，混匀，使用一次性滴管吸去混合样品上清液，缓慢滴加4 滴至测试卡样品孔中。10 min内读取结果。

1.4 犊牛血清BVDV抗原检测

1．4．1 ELISA检测

从-20 ℃冰箱取出先前采集的各牧场血清，恢复至室温后，按照BVDV血清抗原检测试剂盒产品说明书分别对血清和耳组织进行BVDV抗原检测。

1．4．2 BVDV血清抗原检测试剂盒结果判定

检测计算样品的校正OD值。被检样品的S-N值≤0.300，判为BVDV抗原阴性；被检样品的S-N值＞0.300，判为BVDV抗原阳性。

1.5 BVDV病原RT-PCR检测

1．5．1 样品制备

采集血清学抗原检测阳性牛只的粪便、鼻腔分泌物，提取RNA，反转录成cDNA，进行RT-PCR复检。取PCR产物经琼脂糖凝胶电泳和EB染色后，经凝胶成像扫描仪观察目的片段大小。通过胶回收目的条带，送检测序。

1．5．2 引物设计

根据Decaro等[3]采用的方法，设计通用检测引物（表1），由生工生物（上海）有限公司合成。

表1 BVDV引物序列、位置及大小

1．5．3 RT-PCR扩增

按照天根生化科技（北京）有限公司的RNA提取试剂盒说明书方法提取血清中的RNA，根据TaKaRa公司的cDNA合成试剂盒说明书方法将提取的RNA反转录获得cDNA，置于-20 ℃保存备用。

1．5．4 PCR反应体系及扩增条件

PCR反应体系及扩增条件见表2。

表2 PCR反应体系及扩增条件

反应结束后，取8 μL PCR产物经1.50%琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭（EB）染色后，经凝胶成像扫描仪观察目的片段大小。

2 结果

2.1 犊牛腹泻病4联抗原快速检测结果

犊牛腹泻4联抗原快速检测结果见表3、图1，大肠杆菌K99阳性率为43.75%（21/48）。

表3 犊牛腹泻4联抗原快速检测结果

图1 部分犊牛腹泻4联抗原快速检测结果

取大肠杆菌阳性粪便放至装有5 mL 肉汤的培养基中，在摇床中增菌12 h，镜检观察结果（图2）。将培养后的培养液接种于麦康凯琼脂平板上，37 ℃恒温培养12 h后，观察结果（图3）。

图2 大肠杆菌阳性粪培养菌液镜检图片

图3 培养液接种于麦康凯琼脂平板图片

2.2 犊牛血清BVDV抗原检测

犊牛血清共计48 份，抗原检测结果为BVDV抗原阳性4 份，阳性率为8.33%（4/48），见表4。

表4 犊牛血清BVDV抗原检测

2.3 BVDV RT-PCR 结果

粪便共计48 份，RT-PCR结果显示BVDV阳性粪便为14 份，阳性率为29.17%（14/48），见图4。

图4 BVDV病原核酸检测结果

2.4 BVDV阳性结果序列分析

将4 份阳性样品的测序结果使用DNAStar Megalign软件与BVDV基因1-NADL，全基因组M31182.1参考株进行序列对比，此次测序的4 份阳性样品之间的同源性为97.90%～99.20%，XJB-W01株～XJB-W04株与参考基因NADL的同源性分别为67.10%、67.20%、66.70%、65.60%，属于BVDV-1a型。使用MEGA软件将测序的4 株BVDV基因与部分参考株做系统遗传进化树。结果表明，XJB19-01～XJB19-04为同一族，与参考株NADL处于同一进化分支。各毒株间的同源性均在97.00%以上；而各毒株样品与参考基因NADL同源性均在66.00%左右，基因变异较大。同源性比较详见图5，系统进化树图谱详见图6。

图5 各株基因与GenBank上参考基因的同源性比较结果

图6 系统进化树的构建结果

3 讨论

犊牛健康是牧场长期发展的依仗，犊牛腹泻可对牧场造成巨大的经济损失，本试验查明引起该牧场犊牛腹泻的主要因素是BVDV和大肠杆菌。

BVDV感染会对奶牛养殖业造成巨大的经济损失，需要采取有效的防控净化措施。一是发现持续感染牛；二是根据本地本场的牛群密度和感染率来制定防控措施，采取“免疫-检疫-淘汰”策略[4]；三是加强牧场的消毒，制定消毒程序，使用复方醛类、氢氧化钠、生石灰对圈舍、道路、圈舍周边绿化带等进行定期消毒[5]。犊牛刚出生后免疫1 次哞乐优（BVDV-IBR 二连灭活疫苗），间隔1 个月后加强免疫1 次，全群在每年4—10月中普免2 次。全群每年定期做BVDV抗原检测，将阳性或疑似阳性牛隔离，采集鼻拭子、粪便或血清送至实验室提取RNA，使用BVDV检测引物进行RT-PCR复检，淘汰阳性犊牛。针对血清阳性率较高的地区，做好抗原的持续检测，持续免疫，通过淘汰减少阳性牛以及做好综合性生物安全安保体系，维持BVDV的净化状态[6]。因BVD没有特效药物，只能以提高牛只免疫力为主，对症治疗，即时补水，避免脱水死亡[7]。

大肠杆菌引起的犊牛腹泻以抗生素治疗为主，使用大肠杆菌敏感性抗生素，利用药物互补增效的特点联合用药，从而快速控制症状[8]。常用于治疗细菌性腹泻的药物有庆大霉素、土霉素、金霉素等。