汤加勇，李瑞婷，赵 华，贾 刚

（1.四川农业大学动物营养研究所，动物抗病营养教育部重点实验室，四川成都 611130；2.四川农业大学生命科学学院，四川雅安 625014）

近年来，夏季频繁出现的持续高温天气逐渐成为影响动物健康和生产性能的重要因素。热应激是指阻碍身体正常散热，引起热紧张的条件刺激，其本质是指环境温度超过机体热调控区上限时所致的非特异性反应。动物精子的发生是一个温度敏感的过程，高于正常阴囊温度范围可导致睾丸温度增加，影响正常精子发生、精液品质和雄性生殖能力。不同温度的热处理会导致小鼠睾丸重量减轻，降低精子和卵母细胞穿透能力、精子数量、精子活力及存活率[1-2]；降低猴的精子数量[3]；增加奶牛精液中异常精子率，且精子总数、浓度和活力都显著下降[4]；成年健康男性高温热应激后的6～8 个月，形态异常的精子会增加1 倍[5]。就公猪而言，热应激还影响睾酮的分泌及精液品质，并降低性欲，影响繁殖性能。公猪的精液品质不仅直接影响母猪的受胎率，也极大地影响后代仔猪与育肥猪的生长性能。而在炎热夏季，在饲料中添加一定的营养物质可在一定程度上缓解公畜的热应激损伤，从而改善精液品质。本文就热应激对雄性哺乳动物精液品质的影响机理及热应激公猪的营养调控研究进展做一综述，以期为公猪精液的相关研究和生产实践提供参考。

1 热应激影响雄性哺乳动物精液品质的机制

1.1 热应激对雄性哺乳动物血液生化指标的影响 雄性动物的生殖功能由下丘脑-垂体-睾丸（HPT）轴调控，雄激素水平受到HPT 轴的严格调控[6]。精子发生受垂体分泌的促黄体生成素（LH）、促卵泡生成素（FSH）以及睾酮素调控。热应激可引起动物机体生理生化指标变化，造成新陈代谢紊乱，而血液生化指标是反映动物体内物质代谢和某些组织器官机能状态变化的一个重要特征[7]。热应激条件下，动物体内睾酮水平将升高，从而在一定程度上降低了生殖细胞的凋亡[8]。将成年公猪热处理（40℃、5 h/d，8 d）后发现，热处理的第1 天和第4 天血清睾酮素浓度升高，第8 天又回到正常水平；热应激还增强了糖皮质激素受体（GR）在主要细胞和基底细胞细胞核中的表达[9]。但有研究发现，热处理3 d后成年公猪血清睾酮水平、离子浓度、精浆总蛋白等无显著变化[10]。雄性大鼠热处理（40℃、2 h/d，7 d）后第7 天，大鼠的睾丸指数下降、血清睾酮浓度明显上升；HPT轴中许多代谢物，尤其是附睾中代谢物表达水平都发生了上调[7]。成年大鼠进行急性热处理（43℃，15 min）后4～8 周，睾丸激活素A 下降、睾丸激活素B 上升；在第8 周，血清FSH 显著上升，这可能是由于睾丸血清抑制素的反馈减少所致[11]。雄激素受体（AR）是配体激活转录因子，作为雄激素作用的媒介，对雄激素至关重要。将成年公猪进行整体（37～40℃，3 h/d）和睾丸局部（42℃，1 h/d）热处理42 d 后，睾丸中AR 表达水平显著升高[12]，表明短时间的高温应激造成公猪生殖代谢紊乱，急需提高AR 的表达来弥补身体需要的雄激素。

血清中谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）保护细胞免受损伤和清除超氧阴离子自由基，丙二醛（MDA）的浓度可反映机体的脂质过氧化水平，并在一定程度上代表细胞或组织损伤程度[13]。在成年公猪热处理（40℃、5 h/d，8 d）的第1、4、8 天，附睾中MDA 和GSH水平显著升高[9]。热应激显著提高了雄性大鼠血液中GSH、GSH-Px 和SOD 含量[14]；降低了绵羊血糖、胆固醇水平，升高了皮质醇（Cor）、SOD 以及MDA 含量[15]。热处理（32℃，7 d）显著提高SD 大鼠血清中的促肾上腺皮质激素（ACTH）、Cor、白介素-2（IL-2）、IL-6、IL-8、IL-12 水平，而降低了IL-10 浓度[14,16]。热应激提高了公猪体内的抗氧化酶活性，造成了其抗氧化防御系统破坏，从而影响精子的正常生成。

1.2 热应激对雄性哺乳动物睾丸组织的影响 睾丸的主要功能是分泌雄激素（主要是睾酮素）和产生精子。大多数哺乳动物睾丸的温度较其正常体温低2～8℃，其通过阴囊的收紧或放松来调节温度，以达到生精和储存精子的温度要求。精子在睾丸中的发生是一个温度敏感过程，高于正常阴囊温度范围即可导致热敏生精细胞死亡，影响正常精子发生、精液品质等[17-18]。公猪睾丸游离于身体之外，其通过阴囊热调节机制保持温度比肛温低2～3℃；当环境温度高于33℃、公猪体温超过39℃时，阴囊热调节机制失控，导致睾丸温度升高、精细管上皮变性，影响精子生成[19]。

研究显示，成年雄性大鼠急性热处理（43 ℃、15～30 min）或阴囊局部热处理（30 min/d，6 d）均显著降低睾丸重量，热处理后2 周内下降40%，第14 周大多数睾丸参数回归正常，但重量仍略微下降[11,20]。热应激导致睾丸支持细胞和精子细胞中线粒体变性，平滑内质网扩张以及扩大的细胞间隙，生发上皮萎缩和生精停止[20]。大鼠阴囊局部热处理（30 min/d，6 d）后第1天，细胞在曲细精管中受到干扰，生殖上皮细胞彼此分离，并与管状基底膜分离；第14 天，直径较小的未导管化和萎缩的生精小管、生殖细胞严重丧失且被增厚的基底膜包围，表现出明显的组织紊乱和精子发生停止；第35 天，睾丸的组织病理学改变减少，慢慢恢复正常[20]。由上可看出，热应激在很大程度上会降低雄性哺乳动物睾丸的结构和重量。

1.3 热应激对雄性哺乳动物生殖细胞的影响 睾丸由睾丸间质和曲细精管2 部分组成，曲细精管内主要是生殖细胞和支持细胞。生殖细胞通过连续一轮的有丝分裂、减数分裂和细胞分化而变成成熟的精子，易受到热应激影响[21]。在人类和大鼠的生殖细胞中，最易受到热应激影响的是粗线期精母细胞、二倍体期精母细胞和早期圆形精子细胞；精原细胞相对于减数分裂和减数分裂后的生殖细胞，对热应激有较强的抵抗力[22]。大鼠热处理（43℃、15 min）后1 周，其支持细胞数量下降20%，细胞核直径减小15%[11]。热应激对生殖细胞造成损伤，从而影响精子的品质，其主要包括生殖细胞凋亡、自噬、DNA 损伤、氧化应激[22]。

1.3.1 热应激对雄性动物生殖细胞凋亡的影响 热应激对睾丸最大的影响是导致生殖细胞凋亡，而DNA 损伤是细胞凋亡的前兆[23]。隐睾症大鼠睾丸暴露在腹部温度下，发现其生殖细胞发生凋亡，且在初级精母细胞和早期圆形精子细胞中更为明显[24]。局部热处理（43℃，15～20 min）猴的阴囊，导致生殖细胞死亡[25]。将从未性成熟大鼠中分离的雄性生殖细胞热处理（43℃，1 h）后，检测到细胞凋亡发生[26]。热应激除了直接造成生殖细胞凋亡，还可能使细胞存活所必须的细胞质桥变性，影响附睾尾液的组成，从而阻碍精子成熟，促进细胞凋亡[27]。细胞凋亡又可分为内源性细胞凋亡和外源性细胞凋亡。

1.3.1.1 内源性凋亡途径 内源性细胞凋亡又叫线粒体依赖型细胞凋亡，其发生在所有的细胞中。Bcl-2家族包括抗凋亡（如Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-W）和促凋亡（如Bax、Bak、Bcl-XS、Bad）成员，它们可影响线粒体外膜的通透性并诱导细胞凋亡。在正常生理状态下，Bax主要存在于细胞质中，热应激下Bax 整体表达水平不变，但其被再分配到线粒体和内质网中，导致线粒体构象改变，从而使细胞色素C 释放进入胞浆与凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）相互作用，从而诱导细胞凋亡发生；而Bcl-2 在线粒体膜上积累，发生热应激时表达明显上升[3,28-30]。热应激对公猪生殖细胞的凋亡可能是通过Bcl-2 和Bax 的表达和移位来调节。成年公猪环境热处理（37～40℃、3 h/d，7 d）或者睾丸局部急性热处理（43℃，1 h）均导致细胞凋亡信号增强、生殖细胞凋亡，Bcl-2 表达上调，Bax 从胞质向核周核重新分布；Bcl-2 均在对照组和实验组公猪的精原细胞、精母细胞和分化精子细胞的细胞质和细胞核中表达，但其在晚期精母细胞和精子细胞中优先定位于靠近曲细精管的管壁表面[12,31]。热应激对小鼠睾丸造成的内源性细胞凋亡也是由特定的Bax 和Bcl-2 的移位和表达水平变化所触发[3]。由此可见，热应激通过调控Bcl-2 和Bax 的表达和移位来调节雄性动物内源性细胞凋亡，从而影响其精子的生成。

热应激发生时，细胞合成的热休克蛋白（HSP）对精母细胞分裂形成健康、成熟的精子必不可少[27]。热应激导致大多数促进生殖细胞防御、调节的基因被上调，其中最典型的是热休克转录因子（HSFs）。热应激下，热休克因子1（HSF1）激活迅速产生HSP，减少热应激的有害影响[32]；同时HSF1 参与直接消除异常生殖细胞，确保成熟生殖细胞质量良好[33]。热休克蛋白按分子量大小可分为HSP40、HSP60、HSP70、HSP90、HSP105/110 等。HSP60 在热应激小鼠的睾丸中表达量明显升高，且与Bcl-2 表达升高关联，推测HSP60 可能通过与Bax 形成复合体的形式自由释放Bcl-2，促进线粒体依赖型生殖细胞凋亡[3]。HSP70 是HSF1 激活的最常见热休克蛋白，它是外源性细胞凋亡通路中抑癌蛋白P53 的调节因子，同时也参与到内源性细胞凋亡途径中造成细胞色素C 升高，细胞色素C 可活化半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶（Caspase）。Caspase 参与各种结构和修复蛋白的切割，如肌动蛋白、核糖聚合酶等，导致细胞形态发生变化，最终发生凋亡[29-30]。HSP90 存在于公猪精子中，热应激（40℃）条件下HSP90 在非获能条件下通过维持线粒体膜电位和运动对公猪精子活力、获能、顶体状态、线粒体膜电位、质膜脂结构等参数具有较好的保护作用[34]。HSP90 在人类和小鼠的精子获能中是磷酸化的，其还参与孕酮引起的精子亢进和顶体反应[35]。由此可见，热应激条件下，热休克蛋白对精子的健康生成具有重要的作用。

1.3.1.2 外源性凋亡途径 目前发现外源性细胞凋亡途径有Fas/FasL 途径和P53 途径[33]2 种。死亡受体Fas是I型跨膜受体蛋白而其配体FasL 是II型跨膜蛋白，Fas 与FasL 的结合启动外源性细胞凋亡途径[36]。FADD是参与凋亡信号转导的胞质蛋白，Fas 与FADD 通过N端效应域结合可引起细胞凋亡[29-30]。冀睿等[37]通过对成年公猪进行环境和睾丸局部热处理后发现，Fas 主要定位在各级生精细胞，FasL 主要定位在支持细胞、精母细胞以及圆形精子细胞；睾丸局部热刺激条件下，支持细胞FasL 的表达量显著升高，以旁分泌的方式作用于邻近生精细胞膜上的膜受体Fas，引发细胞凋亡；而环境热应激组未见FasL 的升高，可能其凋亡不依赖Fas/FasL 通路。对FasL 和Fas 缺陷的淋巴增生病小鼠进行研究发现，热应激诱导的细胞凋亡仍然发生，表明Fas/FasL 途径不是细胞凋亡的唯一途径[29-30]。热应激显著上调了公猪睾丸组织中TGF-β3 的表达、显著下调了Claudin-1l 的表达，提示热应激可能通过调节TGF-β3和Claudin-11 的表达来影响精子发生[38]。

抑癌蛋白P53 是热刺激生殖细胞凋亡的潜在诱导剂，小鼠热应激后睾丸中P53表达量升高；P53基因敲除小鼠诱发隐睾时，生殖细胞死亡虽有延迟，但仍有发生，表明生殖细胞凋亡是由P53 依赖型和非P53 依赖型共同介导的[39]。小鼠睾丸在高温条件下，P53 从细胞核膜转运到细胞核，与DNA 结合导致细胞周期的停止和细胞凋亡[24]。Fas/FasL 途径和P53 途径相互补充，完成外源性细胞凋亡。内源性和外源性细胞凋亡途径也相互关联，它们交汇于信号通路下游的效应蛋白caspase3、caspase6、caspase7[29]。热应激诱导的早期细胞凋亡是由Fas/FasL 途径完成，而后期细胞凋亡是通过P53 途径完成的[36]。Shaha 等[23]认为热应激诱导的生殖细胞凋亡主要由Fas-FasL 调控。

1.3.2 生殖细胞DNA 损伤及修复 DNA 结构的完整性是保证精子正常功能最重要的因子，在热应激条件下DNA 易损伤，主要损伤形式为单链断裂形式和氧化形式的DNA 损伤。小鼠在急性热应激后第1 天，其生殖细胞（精原细胞、圆形精子细胞）DNA 单链断裂的发生率显著上升[22]。将雄性大鼠和小鼠高温热处理后，发现细胞分裂中期X-Y 二价解离形式的染色体异常增多，二价体不太牢固地结合，产生的未配对Y 染色体将导致精母细胞发生凋亡[40]。高温除破坏DNA 外，还会导致DNA 合成减少，以及许多mRNA 和蛋白质降解[41]。热应激导致大鼠睾丸中DNA 聚合酶β和DNA连接酶III基因表达降低，生殖细胞修复DNA 的能力下降[41]。因此，Tramontano 等[41]认为，热应激对生殖细胞的影响是DNA 修复机制受损导致。但Banks 等[42]认为，由于热应激造成的DNA 损伤太过严重，DNA 修复机制无法进行全部修复，导致部分损伤DNA 进入到成熟、活动的精子中，从而影响精子活力或造成畸形精子。热应激加剧雄性动物生殖细胞DNA 的损伤，从而大大提高了精子的畸形率。

1.3.3 生殖细胞的自噬及氧化应激反应 热应激除了启动生殖细胞凋亡途径外，还能诱导生殖细胞自噬。自噬，也称为II 型程序性细胞死亡，是指细胞被囊泡吞噬，溶酶体降解，以及由此产生的细胞成分循环用于能量产生的过程。热应激条件下，自噬可以与细胞凋亡协同工作，且在细胞凋亡失败的情况下作为备用机制[43]。对小鼠和永生化小鼠精母细胞系（GC2-spd）进行热应激处理后发现，自噬相关蛋白7（Atg7）表达下调导致热处理生殖细胞自噬水平显著降低，Atg7基因敲除引起自噬水平下调，进一步降低了生殖细胞的凋亡率[43]。自噬在热处理后的生殖细胞凋亡过程中起着积极作用，热应激触发生殖细胞的自噬和凋亡，这两种机制是诱导细胞死亡和最终破坏精子发生的促进者而不是拮抗者。

活性氧（ROS）是一种以氧为基础的小分子，在氧化代谢过程中产生，有助于精子获能、顶体反应、精子超活化、精卵细胞融合等过程的发生，但高浓度ROS 会降低精子的运动能力和生存能力[21,44]。体外热处理培养公猪精子显著提高了精子ROS 水平，并可通过L-精氨酸的补充降低ROS 水平[45]。小鼠急性热应激后3 d，其生殖细胞中ROS 水平增加了1.5 倍，且增强了精子膜流动性[22]。ROS 参与热应激方式有2 种假设，第一种是DNA 和脂质等细胞成分的氧化会直接导致细胞凋亡。有研究发现，热应激导致大鼠睾丸中过氧化氢（H2O2）含量增加，脂质过氧化伴随着SOD 和H2O2酶等抗氧化剂活性降低[26]。用过氧化氢酶治疗热应激大鼠可减少过氧化和凋亡细胞数量。第二种假设是ROS的产生会间接触发细胞凋亡的激活，短时间（15 min 左右）热处理，机体产生的ROS 更有可能是触发细胞凋亡机制的信号[8]。由此可见，热应激条件下，ROS 上升均导致生殖细胞凋亡，从而影响公猪精子的生成。

2 热应激对公猪精液品质的影响及其营养调控

2.1 热应激对公猪精液品质的影响 猪缺乏功能性汗腺，且皮下有一层有效保温的脂肪组织，因此对热应激很敏感。当气温高于30℃时，猪体内热平衡被打破，身体机能发生障碍，导致采食量下降、生长缓慢、甚至出现死亡等热应激症状。在6、7 月（夏季高温期）自然热应激条件下，公猪的采精量、精子密度、精子活力以及正常精子数均较4 月呈下降趋势，精液品质下降[46]。母猪受孕率是反映精液品质好坏最直观的指标，高温应激导致公猪精液品质下降，从而降低母猪受胎率。Daolun 等[47]分别采集来自空调舍（27℃）和风机水帘舍（夏季高温超过33℃）公猪的精液对母猪进行人工授精，结果显示空调舍公猪组的母猪受胎率为85.6%，而风机水帘舍公猪组的母猪受胎率只有68.9%。即使夏季温度略高于公猪适应温度阀值（17.7～20℃），如22.2℃，公猪性欲及母猪受胎率就会下降，当温度高于28.3℃时下降更加显著[48]。研究显示，体外热处理（直肠温度38.3～38.7℃，3 d）导致成年公猪的精子总数、活力精子总数、活动精子百分率显著降低，精子畸形率显著升高，热处理后第64 天精子品质恢复到处理前水平[49]。将成年公猪阴囊隔热处理48 h 后发现，精子活力下降、形态异常精子数上升、傅里叶谐波分析形状参数发生变化；将隔热处理时间延长（84～96 h）后，精子数量于3 周后下降至0，直到处理结束后第60 天才恢复正常[50]。正常公猪精液随着体外热处理培养温度的升高及处理时间的延长，精子的总活力、活动精子百分率等显著降低[9]。

综上可见，在炎热的夏季公猪易发生热应激，会严重影响公猪射精量、精子密度、精子活力、精子形态等指标。种公猪在经历高温应激后，其精液品质需经过较长时间才能恢复。低品质、低活力的精子导致人工授精后，进入母猪生殖道内的有效精子数量和品质难以保证卵子成功受精，进而表现为母猪返情、受胎率下降。

2.2 热应激公猪的营养调控 在饲料中添加一定的营养物质可在一定程度上缓解公猪的热应激损伤，从而改善精液品质。在夏季高温环境中，饲料中添加0.5 mg/kg硒、100 mg/kg 锌、70 mg/kg 维生素C、350 mg/kg 维生素E 连续饲喂公猪120 d 能减轻热应激对公猪精液品质的影响；而用缺乏抗氧化剂的饲料饲喂公猪会导致异常精子的发生率显著增加[51]。锌是动物营养需求中必不可少的微量元素，其直接参与精子的生成、成熟、体内保存、获能等过程。公猪连续饲喂含锌1 500 mg/kg的饲料30 d 后，将其连续暴露在40℃高温下8 d（5 h/d），发现加锌组公猪没有出现对照组公猪血清睾酮浓度上升、细胞透明化等现象，且MDA、GSH 水平的上升也得到缓解[9]。L-精氨酸对精子运动有保护作用，在体内和体外补充L-精氨酸均能够降低热应激引起的活性氧水平上升和精子活力下降[45]。用不同浓度的L-精氨酸（0.25、0.5、1.0 mmol/L）处理公猪精液，在39℃下孵育1 h，发现添加L-精氨酸可提高精子总活力和ROS水平、降低线粒体膜电位等，其中L-精氨酸添加量为1.0 mmol/L 时精子总活力最高。夏季（25.5～33.0℃），在公猪饲料中添加L-精氨酸可显著提高公猪精子活力、正常率、精子总数和有效精子总数等[45]。

3 结 语

热应激造成生殖细胞受损的途径十分复杂，可通过生殖细胞内源性和外源性凋亡、DNA 受损及修复、生殖细胞的自噬、ROS 的生成与氧化应激反应等不同的分子路径实现，但各个路径之间彼此交叉，相互联系。在日粮中添加一定剂量的硒、锌、维生素等营养因子可在一定程度上缓解公猪的热应激，从而在一定程度上改善精液品质，提高动物的繁殖性能。