董鸿斐，王 冰，黄 茜，原小惠，孙红玉，汤礼军

自1980年发现成体干细胞的可塑性后，大量研究表明干细胞在促进组织、器官愈合与再生中发挥重要作用[1-2]。为此，人们追求研究各类干细胞，主要包括间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)、神 经 干 细 胞(neural stem cells，NSCs)和多能 干细胞（pluripotent stem cells，PSCs）[3]。目前，基于干细胞的疗法已在骨骼重塑、心肌损伤、帕金森病、糖尿病和眼底病变等多个疾病中研究报道，并普遍被认为是安全、有效的[4-6]。尽管干细胞在组织修复、功能重建和器官再造等方面极具潜力，但干细胞治疗还存在若干不足。通过将细胞外基质（extracellular matrix，ECM）制备成细胞外基质水凝胶（extracellular matrix hydrogel，ECMH），为克服干细胞移植治疗中的不足带来了希望。在此，笔者主要探讨ECMH在干细胞移植治疗中的优势和不足。

1 ECMH应用于干细胞移植治疗的原因

近年来，随着对干细胞移植治疗的研究不断加深，也暴露出干细胞移植治疗中存在的若干问题。首先，在大多数临床试验中，干细胞多在无任何载体的情况下通过注射器或者导管被注射到组织中，导致干细胞在注射过程中泄露及损伤的发生率较高；其次，不论干细胞移植方案如何变化，通常移植后只有少于5%的干细胞在注射部位持续存在并发挥治疗作用[7]；最后，干细胞在机体内处于不同的细胞微环境中，适宜的干细胞微环境有助于保持干细胞的数量并具有调控干细胞的分化成熟的作用[8-9]，但是干细胞移植部位的微环境却常因炎症、创伤和氧化应激等因素影响变得恶劣，不利于干细胞存活及增殖分化，降低干细胞的治疗效果。为改善干细胞移植过程中存在的问题，研究人员在组织工程上进行了多方面尝试，发现水凝胶可以有效改善干细胞治疗中的不足。水凝胶是含水量高的高分子多聚链化合物材料，多聚链通过物理和化学的交联作用保持结构的完整性，从天然材料（如纤维蛋白、海藻酸钠等）到合成材料（如聚乙二醇或聚丙烯酸等）均可制备成水凝胶[10]。在联合干细胞治疗中，水凝胶通过其可构建类似细胞外基质的特性，为干细胞提供适宜的微环境，从而提高干细胞移植治疗效果。Moxon等[11]在生理条件下通过物理混合受控凝胶化将胶原蛋白原纤维掺入藻酸盐水凝胶中，再将人诱导多能干细胞 （induced pluripotent stem cells,iPSC）衍生神经元封装在混合水凝胶内，发现水凝胶中包封的神经元形成了复杂的神经网络，并成熟为可表达突触素的分支神经元。还有大量研究都证明通过构建类似细胞外基质环境可以有效提高干细胞的增殖及分化[12-13]。但在人体内，不同组织的细胞外微环境各有差异，传统的水凝胶制备由于其结构单一及细胞间信号传导的阻断，严重的限制了水凝胶与干细胞复合体在临床中的应用。将为不同组织提供微环境的ECM制备成ECMH，可解决的传统水凝胶的缺点。与传统的水凝胶相比，由于ECMH保留了原有组织内的胶原蛋白、透明质酸、糖胺聚糖和弹性蛋白等，因此具有以下优点：（1）可构成复杂的网架结构；（2）支持并连接组织结构；（3）调节组织与细胞的相互作用。因此，ECMH有望取代传统水凝胶，并广泛应用于干细胞移植治疗。

2 ECMH在干细胞移植中的优势

2.1 为干细胞提供适宜的细胞微环境 干细胞微环境是动态而复杂的，可以通过不同的时间节点和空间结构来共同影响干细胞的表型及特征。而为干细胞提供微环境的基础便是细胞外基质（extracellular matrix，ECM）。ECM的生化成分、力学特征及微管结构，都具有调节干细胞行为的能力，通过对ECM成分的调节，可使干细胞达到预期的表型。基于ECM制备的ECMH可更好的模拟干细胞微环境，从而达到提高干细胞治疗效果的目的。Bordbar等[14]将羊膝关节软骨ECMH与兔骨髓间充质干细胞共同培育，结果表明所制备的水凝胶具有良好的细胞友好性，可以保持干细胞存活。Wu等[15]将猪半月板通过改良的脱细胞作用和酶消化作用，制备成猪半月板组织来源的ECMH，再来培养牛软骨细胞和小鼠3T3成纤维细胞，发现与聚苯乙烯培养比较，猪半月板ECMH能显著提高牛软骨细胞和小鼠3T3成纤维细胞的生存率和增殖速度。这些结果表明由于ECMH因其具有独特的微观结构、力学性能和生物活性，可为干细胞提供更加适宜的细胞微环境。

2.2 对干细胞无细胞毒性 要将ECMH应用于干细胞移植并发挥良好的治疗效果，首先需要确保干细胞可在ECMH中良好生存。因此，ECMH是否具有细胞毒性决定着移植干细胞的命运。Getova等[16]将脂肪组织的ECM制备成水凝胶后，用于培养脂肪间充质干细胞，来评估该ECMH的细胞毒性，连续培养7 d后结果显示水凝胶内细胞存活良好，并在ECMH中观察到脂肪间充质干细胞的存活和迁移。梁成宵等[17]用Live/Dead染色试剂盒检测大鼠肝细胞系BRL-3A细胞在肝脏ECMH中的存活情况,结果发现BRL-3A细胞在肝脏ECMH中培养1 d和3 d后BRL-3A细胞黏附数量明显多于对照组，表明肝脏ECMH并无细胞毒性。以上结果均证明ECMH无细胞毒性，可以保证干细胞良好存活和迁移，有助于提高干细胞治疗效果。

2.3 协同干细胞移植后有较低免疫原性 ECMH作为干细胞组织工程支架材料并应用于临床疾病治疗，除了需要考虑ECMH的细胞毒性，还需考虑其是否会引起移植后免疫排斥反应。Qiao等[18]将猪心肌组织来源的ECMH联合脂肪间充质干细胞后，局部注射至急性心肌梗死后梗死边界处的心肌中，连续观察4 w后，发现脂肪间充质干细胞和心肌ECMH的组合可明显增加血管生成，减少纤维化程度并减小梗塞面积，且未观察到组织免疫反应。Zhang等[19]为了评估衍生自猪膀胱组织的膀胱ECMH在大鼠脑组织中的生物相容性及免疫原性，将膀胱ECMH直接注射到正常大脑后，发现多种大脑组织损伤评估指标无明显变化，提示膀胱ECMH未引起大鼠脑组织免疫反应。因此，ECMH具有良好的生物相容性及低免疫原性的特点，这也有助于协助干细胞体内移植后发挥治疗作用。

2.4 有助于干细胞存活 基于干细胞的疗法可用于治疗多种疾病和损伤，目前主要应用于临床治疗的多为间充质干细胞，其治疗作用通常归因于间充质干细胞释放的细胞因子，这些细胞因子具有调节免疫、抑制炎症反应或促进组织修复的作用[23]，因此保持干细胞的存活及增殖对干细胞治疗效果有决定性作用。Jang等[21]分别使用猪心脏ECMH和胶原两种不同的材料与人源心脏祖细胞联合培养，发现心脏ECMH更能增强人源心脏祖细胞的存活、增殖和分化。Lin等[22]通过将猪外周神经脱细胞化后制备成ECMH用来培养施旺细胞(Schwann's cell)，发现猪外周神经ECMH中的细胞外基质成分和其纳米纤维结构特征有助于促进施旺细胞存活和增殖。Ozpinar等[23]通过使用猪直皮ECMH与I型胶原水凝胶分别培养人源性肥大细胞来观察猪直皮ECMH对肥大细胞代谢活性、细胞活力和受体表达的影响，结果在猪直皮ECMH中培养时，人源肥大细胞表现出不同的代谢活性，同时与肥大细胞成熟/激活相关的免疫球蛋白E（IgE）受体也被上调。上述实验结果表明相较于传统水凝胶，ECMH可明显提高干细胞生存率并有助于干细胞增殖，是一种良好的干细胞培养基。

2.5 具有诱导干细胞向成体细胞分化的作用 干细胞移植治疗的成功还取决于干细胞在移植后是否能够保持其增殖、分化和表型的能力。Bordbar等[14]将羊膝关节软骨ECMH与兔骨髓间充质干细胞共同构建干细胞复合体，观察到嵌入在水凝胶内的骨髓间充质干细胞能够分化成软骨细胞。Zhang等[24]将制备的人胎盘ECMH与高传代（P8）直皮乳头细胞（dermal papilla cells，DPCs）混合成球体后，发现P8-DPCs在传代表达缺失的与毛诱导能力相关的基因表达得到了恢复，进一步将水凝胶-干细胞复合体移植于裸鼠皮下，两周后观察到毛发再生，而单纯细胞移植组无毛发再生现象，证明人胎盘ECMH可通过活化表达关键基因来调节DPCs的形态和功能，使原本不能表达的与毛诱导能力相关的基因表达得到了恢复。以上研究表明，ECMH具有促进干细胞增殖，并诱导干细胞向成体细胞分化的能力。

3 ECMH在干细胞移植治疗中面对的问题

目前，ECMH由于其类似组织的物理特性、独特的3D环境结构特性及出色的细胞外信号转导特性，已被认为是干细胞培养的黄金标准[25]。随着ECMH在干细胞培养和移植方面应用普及，其优势逐渐得以体现，但将人体组织来源的ECMH应用于临床治疗，尚处于生物材料学领域的起步阶段。此外，ECMH的临床应用还需面对以下问题：（1）由于ECMH制备的原材料为动物组织和器官，在临床应用中应尽可能降低组织来源差异引起的免疫反应，所以理想的材料为人体组织，这使得ECMH的原材料供应成为一个首要障碍；（2）从人体组织中获取ECM必须面对个体间变异所产生的组织差异性，差异性的来源包括年龄、性别、种族等多个方面，这些差异极大的降低了ECMH的生产重复性，这种生产批次间的变异影响了其临床应用；（3）由于ECM结构成分复杂，结构的多元化并不利于找们理解细胞外信号及ECM组分在细胞器形成中的作用，这些问题导致在干细胞治疗中，很难根据干细胞种类及应用部位选择最适合的ECMH。

4 ECMH应用于干细胞移植的展望

将ECMH应用于干细胞的体内移植，在临床中的可行性仍未明确，但已有大量的文献综述表明ECMH在干细胞移植中的应用潜力。随着合成和加工技术的发展，ECMH的设计将不断更新。动态ECMH的发展不仅可以为干细胞提供良好的微环境，还将为干细胞提供更加多元的外部触发因素（例如光、声音）[26]。这些动态特性可以更加深层次的影响干细胞的生物信号传导和力学结构形态，为干细胞治疗提供更好的助力。