司晓喜，张凤梅，刘志华，陈 欢，何 沛，刘春波，杨建云，付亚宁，许志刚，朱瑞芝,*

（1.云南省烟草化学重点实验室，云南中烟工业有限责任公司技术中心，云南 昆明 650231；2.国家烟草质量监督检验中心，河南 郑州 450001；3.昆明理工大学理学院，云南 昆明 650500）

薄荷醇是一种广泛使用的调味剂和药物成分[1-6]，其结构有3 个手性碳，有8 种旋光异构体（4 对对映异构体），分别是D/L-薄荷醇、D/L-新薄荷醇、D/L-异薄荷醇和D/L-新异薄荷醇[7]，8 种薄荷醇旋光异构体的结构示意图见图1。不同构型的薄荷醇具有不同的呈香性和生物效用，其中L-薄荷醇具有明显的薄荷香气和清凉作用，并可用作刺激药，应用价值最大，而其他薄荷醇异构体则带有明显的霉味等不良气息或刺激性[8-11]。不同来源的薄荷醇由于异构体含量和构型组成不同[12]，产生的薄荷香气、凉感和药用功效具有差异，特别是L-薄荷醇纯度较低时，严重影响产品品质。建立薄荷醇异构体构型分析技术对含薄荷醇产品的质量控制、品质评价具有重要价值。

图1 8 种薄荷醇旋光异构体结构示意图Fig.1 Structural diagrams of eight menthol optical isomers

目前，有关薄荷醇含量测定和应用技术开发已有大量报道[13-14]，对薄荷醇异构体则主要关注D-薄荷醇和L-薄荷醇对映体的分离，采用的分离检测方法主要有手性柱分离-气相色谱-质谱联用法[15-18]、柱前衍生化-反向高效液相色谱法[19]、正向液相色谱法[20]等，其中以气相色谱-质谱联用法检测法最为简单便捷。Chen Cai等[15]采用手性毛细管气相色谱柱、顶空-气相色谱-质谱联用仪分离检测了烟草制品中的D-薄荷醇和L-薄荷醇，并进一步采用二维气相色谱-飞行时间质谱筛查其他薄荷醇异构体，但由于缺乏标准品并未能准确识别其他薄荷醇异构体。Heumann等[21]利用手性试剂衍生化、19F核磁共振谱实现了8 种薄荷醇异构体的分离和定性，但该方法需要复杂的前处理和多步化学反应步骤，难于用于复杂样品基质中薄荷醇异构体的分离和定量检测。对复杂基质中8 种薄荷醇异构体的分离检测仍然是个难题，由于缺乏薄荷醇旋光异构体的分析方法，无法准确获得含薄荷醇产品中薄荷醇旋光异构体存在和分布情况的完整信息。

本实验通过研究不同固定相的毛细管气相色谱柱对8 种薄荷醇旋光异构体的分离效能，拟建立薄荷醇旋光异构体的串联手性毛细管柱分离、气相色谱-质谱检测法测定，并用于不同类型含薄荷醇食品、药品中薄荷旋光异构体的检测。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

市售16 种含薄荷醇药品（Y1～Y16，其中Y1～Y6为皮肤外用油，Y7～Y11为片剂，Y12为吸入剂，Y13为颗粒，Y14～Y15为外用膏剂，Y16为贴膏）；市售25 种含薄荷醇糖果（T1～T25，其中T1～T14为硬质糖果，T15～T19为软糖，T20～T25为胶基型口香糖）。

甲醇、无水乙醇（均为色谱纯） 德国Merck公司；8 种薄荷醇旋光异构体标准品、乙酸苯乙酯信息参见表1。

表1 8 种薄荷醇旋光异构体标准品和内标物质信息Table 1 Information about 8 menthol optical isomer standards and internal standards

1.2 仪器与设备

Clarus 600气相色谱-质谱联用仪 美国Perkin Elmer公司；KQ-700 V型超声波清洗器（配有温控功能，功率≥200 W） 昆山市超声仪器有限公司；BT224S电子天平（感量0.000 1 g） 德国赛多利斯科学仪器有限公司；3K15高速台式离心机 德国Sigma公司；0.22 μm有机系滤膜 天津市津腾实验设备有限公司；弹性毛细管气相色谱柱见表2。

表2 实验用毛细管色谱柱Table 2 List of capillary columns used in this stuty

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

配制系列质量浓度为0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/mL的8 种薄荷醇异构体混合标准溶液，并加入乙酸苯乙酯内标使内标质量浓度均为20.0 μg/mL。

1.3.2 样品前处理

准确称取一定量的样品，药品样品以含20.0 μg/mL乙酸苯乙酯内标的乙酸乙酯作萃取剂，糖类食品以含20.0 μg/mL乙酸苯乙酯内标的甲醇作萃取剂，样品量和溶剂用量比例一般为1∶100（g/mL）（溶剂用量根据样品中薄荷醇异构体含量进行调整），加盖密闭后于常温下超声萃取，片剂药品、颗粒药品、贴膏、硬质糖果、软糖萃取时间为10 min，外用膏剂萃取时间为5 min，吸入剂、外用油、胶基型口香糖萃取时间2 min，萃取完成后萃取液转移至离心管，以8 000 r/min离心5 min，取上清液过0.22 μm有机系滤膜后进样分析。若样品中薄荷醇异构体含量超过标线质量浓度范围，用萃取剂稀释后再进行测定。不加入样品，按照同样的前处理方法，进行空白实验。

1.3.3 分析条件

气相色谱条件：进样口温度200 ℃；传输线温度230 ℃；载气：氦气（纯度≥99.999%）；进样量1 μL；分流进样（分流比10∶1）。DB-5MS、DB-624、DBALC1和DB-INNOWAX毛细管色谱柱，程序升温条件：初始温度60 ℃，以5 ℃/min的速率升至120 ℃，保持10 min，再以10 ℃/min的速率升至200 ℃，保持5 min，载气流速DB-624柱为2.0 mL/min，其余为1.0 mL/min。BGB-175、CycloSil-B手性毛细管色谱柱，程序升温条件：初始温度50 ℃，保持2 min，以10 ℃/min的速率升至100 ℃，以1 ℃/min的速率升至130 ℃，以10 ℃/min升至200 ℃，保持5 min，载气流速为1.0 mL/min。CycloSil-B+BGB-175串联手性毛细管柱，升温程序条件：初始温度50 ℃，以3 ℃/min的速率升至120 ℃，保持16 min，再以10 ℃/min升至200 ℃，保持10 min，载气流速1.2 mL/min。

质谱条件：电子电离源，电离能量70 eV，离子源温度230 ℃，传输线温度250 ℃；溶剂延迟8 min；检测方法：总离子流扫描和选择离子监测模式，8 种薄荷醇异构体的监测离子均为m/z71、81、95（定量离子m/z71），乙酸苯乙酯的监测离子为m/z104、91（定量离子m/z91）。

1.3.4 定量计算

对系列标准溶液进行测定，以标准溶液中各薄荷醇旋光异构体的定量离子峰面积与乙酸苯乙酯定量离子峰面积的比值为纵坐标，各薄荷醇旋光异构体的质量浓度和乙酸苯乙酯质量浓度的比值为横坐标，绘制标准曲线，内标法定量。样品中各薄荷醇旋光异构体的质量浓度根据标准曲线计算得出，样品中各薄荷醇旋光异构体的含量按下式计算：

式中：X为各薄荷醇旋光异构体的含量/（mg/g）；C为由标准曲线得出的试样中各薄荷醇旋光异构体的质量浓度/（mg/L）；C0为由标准曲线得出的空白中各薄荷醇旋光异构体的质量浓度/（mg/L）；V为萃取液体积/L；M为试样质量/g。

1.4 数据分析

实验中所有数据采用平均值表示，所有指标均重复测定3 次；采用Origin 2017软件进行不同样品中薄荷醇异构体构型比例的主成分分析（principal component analysis，PCA）。

2 结果与分析

2.1 色谱分离条件考察

2.1.1 常规色谱柱分离薄荷醇旋光异构体测定

薄荷醇极性较小，常采用非极性或弱极性毛细管气相色谱柱进行分离，也有报道极性和中等极性色谱柱能实现薄荷醇的分离并获得良好的峰形，定量分析时通常以L-薄荷醇或外消旋的薄荷醇为标准品进行含量计算[22-26]。实验研究了常用非极性的DB-5MS柱、中等极性的DB-624柱、极性的DB-INNOWAX柱、特殊键合固定相DBALC1柱对8 种薄荷醇旋光异构体分离的效果，见图2。可以看出，在优化的色谱分离条件下，以上4 种色谱柱均对薄荷醇有良好的保留，实现4 对薄荷醇对映异构体D/L-薄荷醇、D/L-新薄荷醇、D/L-异薄荷醇、D/L-新异薄荷醇的分离，但不能实现每对对映体D型和L型旋光异构体的分离。对于薄荷醇的4 对对映异构体，物理性质如蒸汽压和沸点在同一对映体对内相同，但非对映体不同，而以上固定相对对映异构体无选择性，因而不能分离同一对映体。对比不同的固定相，不同薄荷醇对映异构体的流出顺序不同，分离度也存在差异，其中极性DB-INNOWAX柱分离4 对薄荷醇对映异构体的效果最佳。根据以上分离情况可知，采用非手性柱分离测定薄荷醇含量时，只包含了D/L-薄荷醇，忽略了其中所含的其他对映异构体新薄荷醇、异薄荷醇和新异薄荷醇。

图2 常规色谱柱DB-5MS（a）、DB-624（b）、DB-ALC1（c）和DB-INNOWAX（d）分离8 种薄荷醇旋光异构体标准溶液的总离子流色谱图Fig.2 Total ion current chromatogram of eight menthol optical isomer standards separated on conventional columns such as DB-5MS (a),DB-624 (b), DB-ACL1 (c) and DB- INNOWAX (d)

2.1.2 手性柱分离薄荷醇旋光异构体测定

环糊精类固定相由于独特分子结构及多个不同的碳手性中心，具有广泛的手性识别能力，但天然环糊精熔点高、成膜性能差，故常对其进行衍生和选择性修饰，提高手性识别的程度和应用范围，已成为最为广泛应用的手性固定相。目前已有较多的研究报道采用环糊精类毛细管气相色谱柱实现部分薄荷醇旋光异构体的分离，认为薄荷醇的六元环部分伸入到环糊精疏水性空腔内，不同手性中心与环糊精作用力的差异决定了手性识别过程[27-28]。不同环糊精空腔大小、不同取代基的环糊精表现出不同的手性分离能力，并可能改变分离物质的流出顺序[17-18]。根据已有研究报道，选择2 种取代基及空腔大小不同的环糊精手性柱进行研究，分别为含七-(2,3-二-O-甲基-6-O-叔丁基二甲基硅烷基)-β-环糊精的CycloSil-B手性柱、含2,3-二-O-乙酰基-6-O-叔丁基二甲基硅烷基-γ-环糊精的BGB-175手性柱，2 种色谱柱对8 种薄荷醇旋光异构体分离的效果见图3。

图3 手性色谱柱BGB-175（a）和CycloSil-B（b）分离8 种薄荷醇旋光异构体标准溶液的总离子流色谱图Fig.3 Total ion current chromatograms of eight menthol optical isomer standards separated on chiral columns BGB-175 (a) and CycloSil-B columns (b)

从图3可以看出，除BGB-175手性柱未能完全分离D/L-异薄荷醇对映体外，其余对映异构体均能实现手性拆分，但由于柱效限制，不同对映异构体的D型和L型异构体色谱峰会发生重叠，从而不能实现8 种薄荷醇旋光异构体的完全分离。从图3还可以看出，两根色谱柱对部分薄荷醇旋光异构体的保留具有差异，即流出顺序不同，例如在CycloSil-B色谱柱上未能实现分离的L-新薄荷醇和D-薄荷醇，以及D-异薄荷醇和L-异薄荷醇，在BGB-175色谱柱上则有较好的分离度。

2.1.3 柱串联技术分离薄荷醇异构体研究及分离效果评价

由于单根色谱柱的柱效有限，以上实验结果及已有报道均表明单一的手性色谱柱未能实现8 种薄荷旋光异构体的完全分离，即使通过增加色谱柱长度提高柱效也难于实现重叠峰的分离，而采用分离性能不同或互补的两根或多根色谱柱串联，则可能提高分离效果[29]。气相色谱串联技术简易的解决方案是采用色谱柱连接器直接将两根柱子串联，根据上述实验结果，CycloSil-B手性柱和BGB-175手性柱对8 种薄荷醇旋光异构体的分离能力具有差异并呈现互补，并且二者规格适配，因此研究了双柱串联对薄荷醇旋光异构体的分离能力。结果显示，CycloSil-B+BGB-175双柱串联能实现8 种薄荷醇旋光异构体的分离，分离色谱图见图4。

图4 串联手性色谱柱CycloSil-B＋BGB-175分离8 种薄荷醇旋光异构体标准溶液的总离子流色谱图Fig.4 Total ion current chromatogram of eight menthol optical isomer standards separated on tandem chiral columns CycloSil-B + BGB-175

进一步通过色谱分离度和柱效率等对CycloSil-B+BGB-175双柱串联分离薄荷醇旋光异构体的效能进行评价。从图4可以看出，除峰5（D-新异薄荷醇）和峰7（D-异薄荷醇）达到基本分离外，其余色谱峰均达到完全分离，满足分离要求。通过计算对称因子对色谱峰的对称性进行评价，8 种色谱峰的对称因子均在0.8～1.0，除L-新薄荷醇色谱峰略微前伸，其余色谱峰对称性较好，表明两根色谱柱兼容性较好，并能与薄荷醇异构体产生较强的作用力保证其在两相中分配平衡，以保持色谱峰的对称性。稳定性方面，8 种薄荷醇选异构体的峰面积和保留时间均具有较好的日内和日间稳定性。此外，柱流失也是影响信噪比（RSN）的关键因素，通过检测中炉温120 ℃、高炉温200 ℃时的基线噪声强度和柱流失质谱图评价柱流失情况。双柱串联在120 ℃炉温时柱流失变化不大，高温时柱流失增加，但与单柱相比柱流失变化不明显，通过基线的质谱图主要识别出甲基聚硅氧烷的典型柱流失离子m/z207、73、281、355，以及改性环糊精上取代基叔丁基二甲基硅基等基团断裂的碎片离子m/z75、89、57，但以上柱流失碎片离子与薄荷醇的定性、定量离子（m/z71、81、95）均不重叠，对薄荷醇异构体的分离检测无明显影响。采用建立的双柱串联分离方法，用于含薄荷醇的药品、糖类食品等不同基质样品的检测，代表性样品检测的选择离子流色谱图见图5，可以看出不同样品中色谱峰分离情况良好，表明CycloSil-B+BGB-175双柱串联满足不同样品中薄荷醇旋光异构体分离检测要求。

图5 含薄荷醇的药品（a）、糖类食品（b）和标准溶液（c）的选择离子流色谱图Fig.5 Chromatograms of menthol in drug (a) and candy (b) and standard solution (c) under selected ion monitoring mode

2.2 定量方法建立和评价

采用以上优化的方法，取系列混合标准溶液进样分析，以各薄荷醇异构体的定量离子峰面积与内标物乙酸苯乙酯定量离子峰面积的比值为纵坐标，质量浓度比值为横坐标，绘制标准曲线。将不含薄荷醇的药品和糖果的样品测定20 次，以空白响应的3 倍标准偏差作检出限，10 倍标准偏差作定量限。选取含薄荷醇的代表性药品和糖果，按照上述实验方法处理后测定，以7 次平行样测定结果计算相对标准偏差。取不含薄荷醇的药品和糖果，添加低、中、高3 个水平含量的薄荷醇异构体标准物质进行加标回收率实验，其中L-薄荷醇添加质量浓度分别为20.0、100.0、200.0 mg/L，其他7 种薄荷醇异构体添加质量浓度分别为0.2、1.0、2.0 mg/L，结果列于表3。结果表明，在所考察质量浓度范围内，8 种薄荷醇异构体的线性相关系数（r2）不小于0.998，方法的定量限为23.0～72.9 μg/L，检测实际样品相对标准偏差（relative standard deviations，RSD）不大于4.3%（n=7），加标回收率为86.0%～116.0%。

表3 线性相关系数、方法的检出限、定量限、精密度和回收率Table 3 Linear correlation coefficients, limits of detection, limits of quantification, precision and recoveries

2.3 样品测定结果

含薄荷醇的药品和糖果中薄荷醇异构体检测结果分别见表4、5。16 个含薄荷醇的药品中检测到的薄荷醇均以L-薄荷醇为主，除了一个样品中L-薄荷醇比例为78.9%，其他药物样品中L-薄荷醇比例高于96.8%；除了两个药物样品外均检测到L-薄荷醇以外的其他异构体，并呈现不同的异构体分布特征，其中D构型薄荷醇检出率高于L构型。25 个糖果食品中，L-薄荷醇比例为71.7%～100%，除了5 个糖果样品外均检测到L-薄荷醇以外的其他异构体，检出率和含量较高的为D-新薄荷醇。D-新薄荷醇等虽然有一定的清凉感和薄荷味特征，但有较强的土样或者发霉的不良气味，L-薄荷醇以外的其他薄荷醇异构体是否会对食品风味和药效带来不良影响，还需结合其阈值等进一步评估[30-31]。

表4 药物样品中薄荷醇异构体含量和异构体纯度检测结果Table 4 Results of determination of menthol isomer contents and percentages in drug samples

目前报道在天然植物中未发现D-薄荷醇，并将D-薄荷醇的存在作为天然来源和合成薄荷醇的鉴别指标[12]，而本实验检测的部分样品中检测出微量D-薄荷醇，但是否能判断以上样品的薄荷醇来源于合成还需进一步确证。以往的方法由于未能实现D-薄荷醇的良好分离，存在未能检测到微量D-薄荷醇的可能性。

表5 糖果样品中薄荷醇异构体含量和异构体纯度检测结果Table 5 Results of determination of menthol isomer contents and percentages in candy samples

2.4 不同样品中薄荷醇异构组成的PCA

不同样品中薄荷醇异构体构型组成存在差异，进一步对不同样品中薄荷醇异构体构型比例进行PCA。从图6可以看出，通过PCA可以将16 种药物、25 种糖果类食品按照其中所含薄荷醇的异构体比例进行一定的区分。通过对样品中薄荷醇异构体的构型组成分析，可能为薄荷醇的来源鉴定、真伪样品鉴别等提供技术支持。

图6 不同药物（a）和糖果（b）样品中薄荷醇异构体构型比例的PCAFig.6 PCA plots of percentages of menthol isomer configurations in different drug (a) and candy (b) samples

3 结 论

本实验建立串联手性毛细管柱分离、气相色谱-质谱法检测8 种薄荷醇旋光异构体的方法，并进行方法评价和验证。建立的方法分离8 种薄荷醇异构体分离度好、响应值和保留时间具有较好稳定性，成功用于不同类型药品和糖果类食品中薄荷醇旋光异构体的定量分析，并获得了不同样品中薄荷醇旋光异构体含量和分布的完整信息。所检测的药品和糖果中薄荷醇异构体均以L-薄荷醇为主，大部分样品中检测到微量的其他薄荷醇异构体。未来工作中，可进一步结合觉察阈值等进一步评估薄荷醇异构体纯度和含量对食品风味、药物药效等的影响。综上所述，本实验所建立的8 种薄荷醇旋光异构体的分离和定量检测方法，在薄荷型食品、含薄荷醇药物的质量控制和评价、薄荷醇产品来源识别等方面具有应用价值，并可应用于其他类型样品的分析检测。