林志燕，杨 萍，黄晓会

（上海交通大学医学院附属新华医院，上海 200092）

西罗莫司又名雷帕霉素，属新型免疫抑制剂，为他克莫司同系物，虽作用于相同受体，但免疫作用机制不同。他克莫司抑制T淋巴细胞由G0期到G1期的增殖，西罗莫司是通过阻断不同细胞因子受体信号传导，从而阻断T淋巴细胞及其他细胞G1期到S期的进程［1－3］，与他克莫司相比，西罗莫司可阻断T淋巴细胞和B淋巴细胞的钙依赖性和非钙依赖性信号传导通路。西罗莫司具有抗肿瘤作用，对肾功能影响更小，目前主要应用于肝移植术后出现肾功能异常、不可耐受钙调磷酸酶抑制剂（CNI）类药品不良反应及存在肿瘤复发风险的受者。西罗莫司虽具有服用方便、吸收好、起效快等优点，但该药个体差异大、治疗窗窄，血药浓度过高易引发肝、肾功能损伤等毒副作用，而血药浓度过低会出现排斥反应［4－6］。西罗莫司血药浓度监测对于指导临床调整用药剂量和频次，制订个体化治疗方案具有重要意义。超高效液相色谱串联质谱（UHPLC－MS／MS）法是以超高效液相色谱（UHPLC）为分离手段，质谱（MS）为检测器的综合分析技术，集UHPLC的高分离性能和MS的高灵敏度、强专属性于一体，极大程度地满足了体内药物分析对高通量、高精密度和准确度的要求，在药物血药浓度监测中发挥了越来越重要的作用，成为临床西罗莫司血药浓度监测的有力工具，尤其适用于移植术后以西罗莫司为辅助用药时血药浓度较低者。本研究中采用UHPLC－MS／MS法测定我院肝移植患者西罗莫司血药浓度。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1290型超高效液相色谱仪、Agilent 6460型三重四极杆质谱仪，配有电喷雾离子源（ESI）、B05.00 Masshunter色谱工作站（美国Agilent公司）。

1.2 试药

西罗莫司对照品（Dr.Ehrenstorfer GmbH公司，批号为CA16970700，含量为95.0%）；依维莫司对照品（European Pharmacopoeia Reference Standard公司，批号为Y0002048，含量为97.9%）；乙腈、甲醇、甲酸等均为质谱纯，水为超纯水。

2 方法

2.1 试验条件

色谱条件：色谱柱为Agilent SBC18柱（50 mm×2.1 mm，1.8μm）；流动相为水（A）－乙腈（B，含0.1%甲酸），梯度洗脱（0～2 min时95%A→20%A，2～4 min时20%A→5%A，4～5 min时5%A）；流速：0.3 mL／min；柱温：40℃；进样量：5μL。

质谱条件：ESI，多反应离子监测模式，采用正离子模式检测；干燥气和雾化气均为氮气，干燥气温度为320℃，干燥气流量为7 L／min，雾化器压力为45 psi，鞘气温度为350℃，鞘气流量为12 L／min，毛细管电压为4 kV，喷嘴电压为0 V。西罗莫司和依维莫司离子对分别为m／z 936.5／409.5，980.6／389.3，碎裂电压分别为330 V和340 V；碰撞能量分别为60 V和64 V。西罗莫司的二极全扫描质谱图见图1。

图1 西罗莫司二级全扫描质谱图Fig.1 Secondary full scan mass spectrum of sirolimus

2.2 溶液制备

取西罗莫司对照品适量，精密称定，用甲醇溶解，并制成质量浓度为1 mg／mL的西罗莫司对照品溶液。称取依维莫司对照品适量，精密称定，用甲醇溶解，并制成质量浓度为70 ng／mL的内标工作液。

2.3 内标全血样品处理

精密吸取全血180μL，置1.5 mL离心管中，加入20μL内标工作液和800μL沉淀剂（0.2 mol／L ZnSO4－甲醇，3∶7，V／V），涡旋混匀5 min，13000 r／min离心10 min，取上清液，经0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，得内标全血样品。

2.4 方法学考察

专属性考察：分别按2.3项下方法处理空白全血、西罗莫司对照品全血和患者全血（供试品溶液），依法进样测定，记录色谱图。结果西罗莫司和依维莫司的保留时间分别为3.266 min和3.285 min，空白全血内源性杂质不干扰西罗莫司和依维莫司的测定。详见图2。

图2 总离子流色谱图1.sirolimus A.Blank whole blood B.Whole blood containing sirolimus C.Test solutionFig.2 TIC chromatograms

线性关系考察：制备西罗莫司质量浓度分别为0.625，1.25，2.5，5，10，20，40 ng／mL的全血加标样品，按2.3项下方法处理，依法进样测定，记录峰面积。以西罗莫司峰面积与依维莫司峰面积的比值（Y）为纵坐标、西罗莫司质量浓度（X，ng／mL）为横坐标进行线性回归，得西罗莫司回归方程Y＝0.0391 X＋0.0257（R2＝0.9995，n＝7）。结 果 表 明，西 罗 莫 司 质 量 浓 度 在0.625～40.000 ng／mL范围内与西罗莫司峰面积和依维莫司峰面积的比值线性关系良好。

定量限考察：分别精密量取2.2项下西罗莫司对照品溶液适量，倍比稀释，依法进样测定，以信噪比（S／N）10∶1计算定量限。结果西罗莫司定量限为0.625 ng／mL。

精密度试验：分别制备低、中、高质量浓度的西罗莫司全血加标样品（2.00，9.00，30.00 ng／mL），按2.3项下方法处理，依法连续进样测定6次，记录峰面积，计算日内精密度；每个质量浓度各制备5份处理全血加标样品，依法连续3 d每日1次进样测定，记录峰面积，计算日间精密度。结果低、中、高质量浓度西罗莫司加标处理样品的日内精密度分别为5.68%，4.21%，3.20%（n＝6），日间精密度分别为9.50%，6.10%，3.75%（n＝5），表明方法精密度良好。

稳定性试验：取精密度试验项下9.00 ng／mL的西罗莫司全血加标样品，按2.3项下方法处理，分别于室温下放置0，2，4，8，10，12 h时，或自动进样器（4℃）放置0，8，16，24，32，40，48 h时，依法进样测定，记录峰面积。结果的RSD均小于10%，表明全血加标样品在室温放置12 h或4℃放置48 h内基本稳定。

提取回收试验：分别制备低、中、高质量浓度的西罗莫司全血加标样品（2.00，9.00，30.00 ng／mL）各3份，按2.3项下方法处理，空白全血样品预处理后添加等量西罗莫司标准品（即A品），依法进样测定，记录峰面积，计算处理后的西罗莫司全血加标样品与A品的峰面积比值，即得提取回收率。西罗莫司低、中、高3个质量浓度的提取回收率分别为102.53%，101.58%，101.85%，RSD分别为9.45%，9.63%，4.30%。

基质效应考察：取预处理后的空白全血适量，分别加入一定质量的西罗莫司对照品，即得质量浓度分别为2.00，9.00，30.00 ng／mL的空白全血加标样品；依法进样测定，以空白全血加标样品与相应西罗莫司对照品溶液的峰面积比值计算基质效应。结果低、中、高3个质量浓度的基质效应分别为95.49%，99.33%，94.63%，RSD分别为9.18%，7.95%，9.98%。

2.5 我院肝移植患者西罗莫司血药浓度监测结果

选取2019年7月至2020年6月在医院住院或门诊监测全血中西罗莫司质量浓度的126例次肝移植术后患者为研究对象。其中，男106例次，女20例次；年龄29～70岁。患者晨起服药前取静脉血2 mL，置含乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管中，当日测定全血药物浓度。126例次肝移植患者西罗莫司血药浓度测定结果见表1，不同性别患者西罗莫司血药浓度测定结果见表2，各年龄组患者西罗莫司药物浓度测定结果见表3，服用西罗莫司后对肝移植患者的血常规、血脂指标和肝肾功能的影响见表4至表6。

表1 肝移植患者西罗莫司血药浓度测定结果（n＝126）Tab.1 Determination results of blood concentration of sirolimus in patients after liver transplantation（n＝126）

表2 不同性别患者西罗莫司血药浓度测定结果（n＝126）Tab.2 Determination results of blood concentration of sirolimus in patients with different genders（n＝126）

表3 各年龄组患者西罗莫司血药浓度测定结果（n＝126）Tab.3 Determination results of blood concentration of sirolimus in patients with different age groups（n＝126）

表4 肝移植患者服用西罗莫司前后血常规比较（±s，n＝126）Tab.4 Comparison of blood routine before and after administration of sirolimus in patients after liver transplantation（±s，n＝126）

表4 肝移植患者服用西罗莫司前后血常规比较（±s，n＝126）Tab.4 Comparison of blood routine before and after administration of sirolimus in patients after liver transplantation（±s，n＝126）

注：与服用前比较，＃P＜0.05。Note:Compared with those before medication，＃P＜0.05.

时间服用前服用后 1个月3个月6个月12个月＞12个月WBC（×109 L－1）5.85±2.774.88±2.014.42±1.564.62±1.694.98±0.944.74±2.61 RBC（×1012 L－1）3.82±0.873.92±0.844.34±0.71＃4.08±0.904.35±0.674.15±0.37 Hb（g／L）114.36±21.94115.40±22.01126.85±18.82121.75±23.24132.50±21.23127.17±10.26 HCT（%）33.97±6.1733.95±6.5337.48±5.4335.76±6.6039.41±6.35＃37.73±3.84 PLT（×109 L－1）167.18±114.33146.30±69.08158.10±87.31158.50±96.20146.00±92.85160.17±103.49

表6 肝移植患者服用西罗莫司前后肝肾功能比较（±s，n＝126）Tab.6 Comparison of liver and kidney function before and after administration of sirolimus in patients after liver transplantation（±s，n＝126）

表6 肝移植患者服用西罗莫司前后肝肾功能比较（±s，n＝126）Tab.6 Comparison of liver and kidney function before and after administration of sirolimus in patients after liver transplantation（±s，n＝126）

时间服用前服用后 1个月3个月6个月12个月＞12个月ALT（U／L）44.23±49.8034.76±54.3325.84±19.0630.88±20.1331.63±22.1526.33±12.53 AST（U／L）45.73±33.4939.52±37.1735.89±25.3446.56±39.7244.75±37.4629.00±6.75 Cr（μmol／L）119.98±81.33104.05±43.3794.33±28.1587.34±35.2086.45±21.69102.37±28.66 BUN（mmol／L）13.00±11.188.95±4.367.74±3.357.32±4.637.29±1.619.08±3.07

3 讨论

表5 肝移植患者服用西罗莫司前后血脂水平比较（±s，mmol／L，n＝126）Tab.5 Comparison of blood lipid levels before and after administration of sirolimus in patients after liver transplantation（±s，mmol／L，n＝126）

表5 肝移植患者服用西罗莫司前后血脂水平比较（±s，mmol／L，n＝126）Tab.5 Comparison of blood lipid levels before and after administration of sirolimus in patients after liver transplantation（±s，mmol／L，n＝126）

时间服用前服用后 1个月3个月6个月TC 4.16±1.824.55±0.825.68±0.914.83±1.15 TG 1.83±0.671.92±0.962.30±1.471.87±0.76 HDL 1.46±0.421.29±0.521.57±0.451.33±0.26 LDL 2.49±0.922.63±0.643.67±1.093.11±0.97

国外学者认为，5～15μg／L是西罗莫司合适的血药浓度范围［7］。国内多数学者认为，西罗莫司血药浓度应维持在4～8 ng／mL，可同时获得较高的疗效和较低的高脂血症发生率［8－9］。熊樱等［10］认为，术后1～3个月为4～6 ng／mL，第4～6个月为3～6 ng／mL，＞6个月3～5 ng／mL，在此血药浓度范围内，通过与环孢素或他克莫司联用，可获得较好的免疫抑制作用及较少的药品不良反应［10］。对于西罗莫司血药浓度稍低于有效血药浓度的患者，有文献报道西罗莫司和他克莫司稳态血药浓度之和在6.1～15.5 ng／mL范围内，总体免疫抑制疗效满意［11］。西罗莫司在人体内的生物利用度存在个体差异，影响西罗莫司血药浓度的因素包括剂量／体质量、年龄、疾病状态、器官移植类型等［12］，以及食物、腹泻、贫血状态、药物相关作用等其他因素［13］。西罗莫司宜空腹、餐前1 h或餐后2～3 h服用，低脂饮食，利于药物最大吸收。联用抑制CYP3A4代谢的药物（如三唑类抗真菌药、红霉素、克拉霉素、钙通道阻断剂等）能增加西罗莫司血药浓度，CYP3A4诱导剂（如利福平、卡马西平等）能降低西罗莫司的血药浓度［14－15］。临床治疗过程中需密切监测其血药浓度变化。西罗莫司的半衰期较长，为57～62 h，若给予负荷剂量，需3～4 d监测血药浓度，如不给予负荷剂量，应在5～7 d监测血药浓度，一旦调整维持剂量，应以新的维持剂量连用7～14 d后再在血药浓度监测下进一步调整剂量。获得稳定的血药浓度后可每月复查1次，移植时间较长、血药浓度稳定的患者可每3个月监测1次。

我院的126例次西罗莫司稳态血药浓度监测结果在3～8 ng／mL范围内的不足半数（53例次，42.06%）。性别对西罗莫司稳态血药浓度无明显影响，而不同年龄段患者西罗莫司稳态血药浓度有一定差异。

除性别和年龄因素外，在今后的研究中还应考虑患者是否同时服用其他药物及其自身生理病理状况等因素对血药浓度的影响。本研究病例数较少，对西罗莫司血药浓度的影响因素还有待数据积累研究。虽然目前我院现有样本数还不足以解释各因素对西罗莫司血药浓度与疗效间的关系，但可为临床制订个体化给药方案提供参考，为本地区肝移植患者血药浓度参考值的制订提供依据。本研究中患者在服用西罗莫司3个月的红细胞计数和12个月红细胞比容与服药前相比虽有显著差异，但均在正常范围内，故无临床意义。患者服药后与服药前的肝肾功能、血脂指标相比无显著差异，得出无差异的结果可能跟样本量较小有关。另外，由于此次观察的病例数较少，观察时间较短，故尚不能得出西罗莫司不同血药浓度与患者血常规、肝肾功能、血脂关系的结论，今后还有待进一步深入研究。

综上所述，西罗莫司在人体内的生物利用度存在个体差异，监测血药浓度有助于及时调整其用药剂量，确保临床用药安全、有效。