李博钰 孟 丹

由于颅面结构的复杂解剖，颅面组织从创伤、手术切除或先天性畸形中完全恢复是极具挑战性的［1］。而作为金标准的自体骨移植也由于其外形难以与受区匹配，存在一定的局限性。在近几十年来，骨组织工程（bone tissue engineering, BTE）快速发展。骨组织工程的三个主要研究内容分别是骨组织工程三维多孔支架、骨种子细胞和生长因子［2］。其中支架的材料与制造是研究的重点，它需要适合细胞的生长繁殖并在结构上能够使再生的组织成熟并行使功能。

3D生物打印（3D bioprinting, 3DBP）源于3D打印，通过逐层打印由生物材料和（或）细胞以及生物因子组成的生物墨水（bioinks），以高分辨率制造载有细胞的结构［3,4］。相比于3D打印，理想的3D生物打印可以更好地控制细胞和生物因子在支架中的分布，从而更利于组织再生，但目前也面临着许多挑战，比如可打印性、机械性能、血管化等［5］。随着3D生物打印技术和材料学的不断发展，研究者们致力于通过改进生物打印的参数和发现更合适的材料以解决现存的挑战。本文将概述骨组织工程的3D生物打印及其研究进展。

1.骨组织工程

骨组织工程作为一个十分有前景的研究方向，通过结合生物活性分子、细胞和生物材料来构建仿生支架来恢复病变或受损的骨组织［6］。传统意义上的骨组织工程是将种子细胞接种于支架上后进行培养。传统的骨组织工程支架制备方法包括溶液浇铸/离子洗出法、原位成型法、静电纺丝法、相分离/冻干法、气体成孔法等［7］，虽然用这些工艺制备出的支架进行骨组织工程取得了一定的成果，但研究者们的要求并不止于此。

首先传统的支架制备方法是减法制造，即从整块的材料中去除部分材料以得到目标结构［7］。但这类方法控制几何形状的能力有限，无法实现对支架材料和孔隙结构的精确控制，结构形状也无法与骨缺损部位完全契合，不能实现个性化植入物的制备［8］。另外，这种在体外制造支架后再接种种子细胞的方法属于无细胞支架制造技术，无法精准控制细胞的分布，无法保证所需的细胞密度、细胞铺展、粘附、迁移和体内外相互作用［9］。

2.3D生物打印

随着增材制造（additive manufacturing,AM）——也称作3D打印——的出现，其逐层打印的方式克服了传统支架制造方法在结构复杂性和空间异质性上的限制。而3D生物打印则克服了支架制造-细胞接种方法的弊端，将细胞在打印过程中直接封装在支架内，即同时将生物材料和细胞沉积到设计的位置。其高通量制造和对细胞的精准控制［10］，在近十年来备受关注。

2.1 3D生物打印技术 目前可以有效地在骨支架内沉积和分布细胞的3D生物打印技术有基于喷墨的生物打印［11］、基于光的生物打印［12］、基于挤出的生物打印［13,6］。

2.1.1 基于喷墨的生物打印 基于喷墨的生物打印（inkjet-based bioprinting, IBP）通过热、压电或声产生的力将液滴喷射到控制台上，由于其高速、高通量、高精度且低成本的特点使其应用广泛［14］。但它的缺点是生物墨水必须呈液态且呈低粘度，否则易堵塞喷嘴。这限制了生物墨水的细胞密度。而且液滴喷出后固化的延迟限制了垂直方向上（z轴）的分辨率［15,16］。

2.1.2 基于光的生物打印 基于光的生物打印（light-based bioprinting, LBP）是所有打印技术中速度最快、最精确的技术，且不受材料粘度的限制，包括激光辅助打印（laser-assisted printing，LAP）和立体光刻（stereolithography，SLA）［15］。前者是一种基于激光诱导前向转移（laser-induced forward transfer，LIFT）的无喷嘴技术，它利于打印二维结构（例如皮肤），但最近的一些研究发现可以用这种方法制造复杂的3D结构［9,15］。后者利用光（紫外线或可见光）逐层选择性地固化液态的光固化材料，拥有非常好的形状保真度。激光打印的优点是高分辨率、可以打印复杂结构和高粘度（高细胞密度）材料，但光对组织的损害以及高成本是它的缺点［15］。

2.1.3 基于挤出的生物打印 基于挤出的生物打印（extrusion-based bioprinting）是最常用于骨组织工程的3D生物打印技术［4］，通过气动或机械驱动将连续的生物墨水流以设定的速度和量从喷嘴中挤出到工作台上［3,17］。它可以打印的生物材料范围十分广泛，包括水凝胶、共聚物和球形细胞团。但它主要的缺点是剪切应力、细胞聚集和沉淀会导致细胞活力下降。生物墨水的流变性（粘度）、打印速度（流速）等因素都会影响细胞所受的剪切应力。通过改善打印参数（流速、打印喷嘴的形状和长度等）、寻找适当的生物打印窗口（biofabrication window）——即在打印性能和细胞活力之间权衡——研究材料的热交联和剪切稀化的能力，可以优化此打印技术［3,18-20］。另一个问题是分辨率低，100μm为最佳分辨率，但是特别适用于高粘度、高细胞密度的生物墨水［21-23］。

2.2 生物墨水 生物墨水（bioinks）是3D生物打印的重要环节，也是近十几年来的研究热点［4］。生物墨水被装载在打印机料筒中（EBP和IBP），经由打印喷嘴将其放置在设计的位置后固化，或在打印平台上，由光/激光固化（LBP）。它可以由一种或多种天然或合成生物材料制成，也可以由没有任何其他生物材料的细胞聚集体制成［4,8］。本文仅讨论含细胞的生物墨水。用于骨组织工程的生物墨水中封装的细胞常用的有人骨髓间充质细胞（hMSCs）、人脂肪间充质干细胞（hASCs）、前成骨细胞、人脐静脉内皮细胞（HUVECs）等，与无细胞支架制造技术应用的接种细胞种类大体一致。理想的载细胞生物墨水有以下要求：（1）具有良好的生物相容性，能够模仿天然组织的微环境，并可生物降解；（2）可打印性：具有良好的流变特性，且在打印后有良好的形状保真度；（3）具有足够的机械强度，且与目标组织相匹配；（4）保持细胞活力，且促进细胞分化；（5）可定位功能性生物因子（例如血管内皮生长因子VEGF）以利于植入后封装细胞的活性和新生组织向内生长［4,24］。

确定最佳的载细胞生物墨水配方是成功生物打印的关键步骤，到目前为止，各种具有特定特征的天然和合成生物材料已经被用作生物墨水［4］。常用的生物材料主要是水凝胶类，还可将其与多种材料结合组成复合材料。

2.2.1 水凝胶 水凝胶有着很好的生物相容性、可降解性和保水性。多数还有利于细胞粘附、增殖、分化的细胞结合位点［4］。水凝胶可以分为天然水凝胶和合成水凝胶。已用于骨组织工程的天然水凝胶包括海藻酸盐（alginate, Alg）、壳聚糖（chitosan, CS）、明胶（gelatin, Gel）、胶原、丝蛋白（silk fibroin, SF）和透明质酸（HAc）等，后者包括甲基丙烯酸化明胶（GelMA）、聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDMA）、Pluronic F-127等［4,15,25］。水凝胶可通过热、离子、酶促和光交联。高温可能会对细胞造成不可逆的损伤，然而有研究已经证明周围环境温度上升4-10℃，2μs内不会对细胞产生致命损伤［26］，热会在细胞膜上造成瞬时的孔，但会在打印后2h内修复，且孔有利于基因和大颗粒的递送［27］。蛋白质类的水凝胶多用酶促交联，这种方法的优点是较温和；CaCl2是最常用的海藻酸盐离子交联剂［6］。对于离子交联和酶促交联来说，如果在打印过程中交联，则需要共挤出生物墨水和交联剂，或依次沉积两种组分；若在打印后交联，则需要多种交联机制的混合物［28］。例如Chen等［29］用双交联的方式，先后用转谷酰胺酶TG交联明胶并用Ca2+溶液交联藻酸盐，制备了藻酸盐/明胶水凝胶的互穿聚合物网络（interpenetrating polymer network，IPN），提高了构建体的结构完整性。

2.2.2 复合材料 复合材料结合了每种组分的优点，在机械强度、可打印性、生物相容性和凝胶化特性方面有所提升［15］。例如海藻酸盐虽然有高吸水性、生物相容性和生物降解性，但它是一种相对生物惰性的材料，缺乏细胞粘附配体。但通过对其进行修饰，例如将RGD肽偶联到海藻酸盐上以产生细胞结合位点［4］。

纳米粒子（nanoparticles）由于量子效应和较大的表面积对体积比，具有各种尺寸、形态和表面修饰的纳米材料具有独特的物理、机械、光学、化学和生物特性，可以用来修饰支架的性能，比如机械性能、骨传导、骨诱导和骨整合性能，还可以用于药物传递［30,31］。纳米羟基磷灰石（nHA）可以以粉末或涂层的形式与壳聚糖、胶原、海藻酸盐、明胶等材料复合［31,32］。Gao等人［33］将含hMSCs的PEGDMA材料与nHA用热喷墨技术共打印，发现HA可显著刺激hMSCs的成骨分化以及成骨ECM的产生，PEG-nHA组中胶原蛋白的产生最多，碱性磷酸酶的活性最高。Miina等人［34］在明胶-海藻酸盐生物墨水中加入木质纤维素纳米纤丝（wood-based cellulose nanofibrils，CNF）和生物活性玻璃（BG），发现BG有刺激早期成骨作用，但生物墨水的粘度也随之增加导致剪切应力增加，细胞活力下降，加入CNF后依赖其剪切稀化特性降低粘度，改善流变性，提高了可打印性。G.Cidonio等人［35］将带静电的纳米硅酸盐（nSi）加入到纳米处理离子共价缠结（nanoengineered ionic covalent entanglement，NICE）生物墨水中，共价交联的弹性GelMA和离子交联的脆性κ卡拉胶（κCA）通过应力分散提高了机械强度和粘度，nSi与前两者形成非共价静电键，提高了剪切稀化能力，且在转录组学水平诱导成骨分化。碳纳米管（Carbon Nanotubes，CNTs）［36］是石墨空心管状结构，由通过sp2键连接的碳原子片制成，具有出色的电学性能和较高的机械和化学稳定性［30］，可以改善支架的机械性能［37］。虽然它有一定的细胞毒性，但有研究用CNT和明胶、海藻酸盐做混合材料打印血管结构时发现少量（0.5%，w/v%）应用对细胞毒性很小［38］。纳米纤维素由模仿胶原纤维网的纳米纤维组成，含水量高，具有良好的机械强度和剪切稀化能力［3］，如上文研究［34］中所述可以改善生物墨水的可打印性。硅酸镁锂（Laponite，LPN）是一种合成纳米黏土，可以与蛋白质相互作用，刺激成骨作用；改善生物墨水的机械强度，提高生物墨水的粘度和尺寸稳定性；改变流变特性，剪切稀化能力［24,39］。Yang-Hee等人［24］将LPN与GelMA结合形成复合生物墨水，hBMSC活力在LPN-GelMA中培养21d没有显著变化且能观察到增殖，而hBMSC活力在GelMA中显著下降。载hBMSC的LPN-GelMA支架中有矿化结节形成，且LPN-GelMA-VEGF支架显示出比GelMA-VEGF更好的血管穿透性。Zhao等人［40］用羧甲基壳聚糖（CMCh）和无定形磷酸钙（ACP）制成复合纳米颗粒水凝胶支架。ACP相比于磷酸三钙（TCP）和HA来说有更好的骨传导性和生物降解性，但高度不稳定，故利用壳聚糖的阴离子衍生物CMCh稳定ACP 纳米颗粒。该支架显着增强骨形成蛋白-9（BMP-9）诱导的体内骨形成的效率和成熟度，同时抑制长期异位成骨中发生的骨吸收。

2.2.3 生长因子 还可以根据需求在水凝胶中添加相应的生长因子，例如骨诱导剂地塞米松、骨形态发生蛋白BMP、骨形成肽BFP-1，血管生成诱导剂VEGF等［35,37］。Luo等人［41］研究了双肽负载的海藻酸盐基水凝胶系统。因海藻酸盐不含细胞粘附配体，故用整合素结合配体（RGD肽）与海藻酸盐聚合物链偶联，增强细胞活力并促进细胞增殖。当细胞扩增后，载有BFP-1的中孔二氧化硅纳米粒子（MSN）pep@MSNs 释放BFP-1，诱导hMSC 成骨分化。虽然生长因子如BFP-1、BMP-2可以刺激成骨，但半衰期短，很快被血液清除。如果要实现生长因子在缺损部位的高浓度持续刺激，同时避免大剂量使用的副作用（水肿、神经刺激等），可以通过（1）转运载体中BMP-2蛋白的物理结合或捕获来控制释放；（2）运用基于基因转导的细胞基因工程［42,43］。例如将BMP-2封装在聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）微粒［42］或壳聚糖微球中［37］，能持续释放BMP-2超过30d；或用明胶水凝胶［42］捕获BMP-2，也可以持续释放BMP-2。壳聚糖这种天然阳离子聚合物可作为DNA质粒的有效载体，转染外源基因到人体细胞中［37］，Zeng等人［44,52］将含有BMP-4和血管内皮生长因子受体（VEGFR1）基因的重组质粒与壳聚糖制备成纳米颗粒，植入骨缺损兔子中，与对照组相比骨缺损修复速度更快，新生骨质更多。Lin等人［42］将BMP-2慢病毒载体转导的hBMSCs封装于明胶水凝胶中，用基于可见光的立体光刻技术打印了支架。体内外实验中都表现出较直接加入BMP-2的对照组更有效地保持BMP-2浓度和生物活性，促进更快更有效的骨形成（成骨基因的表达以及成骨的体积及质量均有显著性差异）。氧化石墨烯（Graphene oxide，GO），是一种含多种官能团的芳香烃，尺寸通常在纳米至数微米。Goeun等人［45］在3w/v%的海藻酸盐中混合0.5mg/mL GO，提高了生物墨水的可打印性、结构稳定性、成骨诱导性。

3.研究进展

3D生物打印骨组织工程支架一直以来的挑战是水凝胶机械强度不足以及血管化［7,15］。机械强度可以通过上述复合材料的方式增强，也有学者通过制造生物陶瓷-载细胞水凝胶双相支架构建支架［46,47］，初步解决了这个问题。

在过去的20年里，人们一致认为重建能保证稳定灌注的多级血管网对于成功建造大多数复杂组织是十分重要的［48,49］。一直以来骨组织工程面临的挑战就是构建体的血管化。大型结构的构建存在几何结构复杂、组成多样以及血管化的限制。虽然在几何复杂性方面取得了重大进展，多组分结构也可以通过多喷嘴打印解决，但血管化的问题仍然困扰着研究者们，如同组织工程中的圣杯［50,51］。尽管通过单纯地掺入VEGF等因子可以一定程度上促进血管生成，但是还是需要研发一些特殊的打印方法如结构仿生、时空控制释放生物活性因子等，以完成复杂且互相连通的血管网络的形成。Irene等人［52］用顺序诱导法，先打印明胶-nHA支架，接种hMSC后先后在生长培养基（GM）和成骨培养基（OM）中培养1周和2周，获得含有预分化的hMSC的支架，再将含有HUVEC：hMSC为4∶1的GelMA-纤维蛋白水凝胶填充到支架的大孔中，光交联后在含或不含成骨培养基的内皮培养基中培养2周。发现在有良好的骨生成的同时成功地诱导了稳定的复杂且互连的毛细血管网络形成。水凝胶中未分化的hMSC作为周细胞稳定了脉管系统。Takahisa等人［53］通过两步式数字光处理（digital light processing，DLP）技术，先在外围打印含磷酸八钙（OCP）的GelMA环模仿骨皮质，之后在中央打印包含HUVEC球体的GelMA环模仿骨髓空间。HUVEC可以在GelMA水凝胶中形成3D毛细管网络。植入缺损部位后，均匀地嵌在GelMA中的OCP刺激间充质干细胞的成骨细胞分化，预血管化将促进骨组织修复，血管化后宿主中迁移的MSCs或前成骨细胞可在OCP 的影响下分化为成骨细胞。Charlotte等人［54］用装载两种——成骨（MSC）和血管源性（大鼠主动脉内皮细胞）——独立的细胞群的纤维蛋白生物墨水与PCL共打印制备3D生物打印双相类骨支架。纤维蛋白具有诱导血管生成并促进细胞附着和增殖以及体外促进成骨的潜力，但是缺乏机械强度。机械强度高且多孔的基质PCL与纤维蛋白水凝胶共打印，降低了降解速率，维持长时间的机械稳定性，允许新的骨骼形成。体内外实验中均体现出更好的成骨能力和血管生成能力。Batzaya等人［55］用基于挤出的生物打印制造了包含可灌注血管腔的微结构类骨组织构建体。该构建体由28个圆柱体组成一个三棱柱，中央的一个圆柱体由装载HUVECs和hMSCs的低质量分数GelMA（GelMALOW）的生物墨水打印，打印外围圆柱体的生物墨水由装载hMSCs的共价结合VEGF的高质量分数GelMA（GelMAHIGH）组成，同时含有nSi以诱导hMSCs的成骨分化，VEGF的浓度从内到外逐渐增高。GelMALOW较GelMAHIGH降解速率高，体外培养12天后内芯降解留下开放的管腔和500μm的可灌注通道，HUVECs和hMSCs迁移到该通道的内表面，可灌注通道充当中央血管；构建体外围的nSi以及成骨培养基的持续灌注诱导了的hMSC分化为骨组织。在体外研究中观察到了毛细血管状网络形成。

4.总结与展望

尽管3D打印在过去的几十年里已经发展得较为成熟，但可以在高温、高压力等条件下进行的3D打印的难度无法与载细胞的3D生物打印相提并论。3D生物打印皮肤、肝脏等组织器官已经成功设计并植入人体内，但骨组织工程的3D生物打印由于其对机械强度的要求尚处于起步阶段且仅限于实验室内，距离临床应用还有很长的路要走。

目前3D生物打印已经走向骨组织工程的商业化和最终进展阶段，尽管该领域取得了显著的进步，但为复杂的组织制造设计合适的生物墨水仍然是一个长期的挑战。其中3D生物打印技术已经形成较为成熟的体系，这一方面的改进是通过优化打印参数，在兼顾细胞相容性的同时提高可打印性；而对生物墨水和打印方法的创新是探索同时满足机械强度和良好的细胞相容性以及血管化这两个主要方面。载细胞打印将生物墨水限定于水凝胶，通过结合多种新型材料、生物因子以改善机械性能、可打印性、细胞活力、成骨能力和血管化能力。而对打印方法的改进多数基于对天然骨小梁和（或）血管结构的模仿，结合水凝胶与其他聚合物打印双相甚至支架，在空间上制造生物因子浓度梯度，诱导支架在成熟过程中形成目标组织。

对于骨组织工程的一大难题——血管化——也已经有了许多新思路，通过顺序诱导或多相材料共同培养等方法模仿天然的复杂骨结构。甚至可以将时间概念与3D生物打印结合，也就是4D生物打印，通过研发刺激响应型水凝胶，在3D生物打印过程结束后可以自发地在各种刺激下改变其特性，更顺应体内微环境［23,36,56,57］。但目前仍处于实验室阶段，距离实际应用还有一定距离。在不远的将来，我们仍需要更多研究来实现将具有良好血管化能力的3D生物打印骨组织工程支架应用到临床。