牛德云，李吉玲

(1.云南警官学院，云南 昆明 650233；2.昆明市第一人民医院，云南 昆明 650034)

1 引言

滇重楼主要分布于云贵川三省，而盛产于云南，生长在海拔较高的山区阔叶林、坡地、松林中。滇重楼自古以来就是民间重要的草药，也是著名中成药云南白药、宫血宁胶囊等药品的主要原料[1,2]。近年来，随着新型中成药市场的开拓，对重楼原材料的需求量逐年剧增，传统重楼种植已经满足不了市场的需求。研究者们另辟蹊径，转为研究重楼内生菌代谢产物来应对中药材资源短缺的问题，滇重楼内生菌分为内生真菌和内生细菌，这些内生菌通过寄生的方式产生各类活性成分，如抑制其他微生物活性、抗肿瘤细胞活性等作用[3]。另外，滇重楼内生菌的代谢产物对抑菌、镇静镇痛、抗细胞毒素有一定作用，临床上还尝试用于治疗部分肿瘤，具有显著的疗效[4,5]。

目前对滇重楼内生真菌代谢产物的研究居多，通过研究其代谢产物，分离鉴定出大批活性物质，其中口山酮类化合物是其中的一种，课题组前期对一株滇重楼内生真菌(与本研究所选菌株YNCY0884属同一批次分离鉴定所得)代谢产物进行了研究，分离得到多个口山酮类化合物，这些化合物在本次所选菌株的代谢产物中也出现，说明同一植物的不同内生真菌代谢产物有一定的相似性。

本文旨在发现滇重楼内生真菌代谢产物中口山酮类化合物，对比前期研究过的同一批次分离所得的菌株代谢产物，结果发现两者代谢产物中均存在口山酮类化合物，前期对口山酮类新化合物做细胞毒活性检测，结果表明该类物质具有良好的活性。鉴于此，为进一步深入研究该类物质，挖掘其背后的药用信息，本研究有针对性的开展分离工作，初步分离便获得目标化合物，预计下一步的分离中会发现新颖口山酮类化合物。

2 材料与方法

2.1 仪器与试剂

紫外分光光度计 (Spectrumlab 24)，红外分光光度计 (Bio-Rad FTS-135)，旋光仪 (JASCO DIP-370)，半制备高效液相色 (Agilent-1200)，旋转蒸发仪 (EYELA-N-1100D)，核磁共振仪 (Bruker AM-500)，质谱仪(VG AUTO Spec-3000)，半制备色谱柱 (Venusil XBP-C18) ，LDZX-40B1型立式自动电热压力蒸汽灭菌锅，隔水式恒温培养箱(上海恒科学仪器有限公司)，LRH-150-G光照培养箱(广东省医疗器械厂)，LRH-250-G光照培养箱(广东省医疗器械厂)，ZHWY-2102恒温培养振荡器(上海智成分析仪器制造有限公司)，恒温摇床，超净工作台，500 mL罐装瓶, 电子天平。

2.2 材料

菌株经鉴定为滇重楼内生真菌，菌株编号为YNCY0884。菌株筛选完成后进行培养，然后进行放大发酵。

2.3 提取和分离

固体发酵产物收集于50 L工业塑料桶中，用大于提取物2.5倍质量的工业乙醇浸泡3～5 d，超声处理3次，浓缩除去乙醇，共提取3次，合并提取液并浓缩；所得浓缩产物用乙酸乙酯萃取3次，乙酸乙酯相减压浓缩得到浸膏。所得浸膏520g，浸膏用甲醇溶解后用硅胶拌样，样品装填大型硅胶(100-200目)柱层析初分划段，用不同比例的氯仿-甲醇流动相分为6个极性段 20∶1(Ⅰ)、9∶1(Ⅱ)、4∶1(Ⅲ)、7∶3(Ⅳ)、3∶2(Ⅴ)、1∶1(Ⅵ))。

用前期分离完成的一个菌株的目标单体化合物为对照，经TLC监测发现口山酮化合物主要分布于Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ三个组分。选取Ⅱ、Ⅳ组分分别经甲醇溶解，采用0.45 μm 微孔过滤膜过滤后，用C18反相柱，以 60% (乙腈：水)作流动相，流速为 3 mL/min分别划分为6段和4段。用半制备高效液相对划分后的Ⅱ、Ⅳ段组分进行细分、纯化得到化合物1(15.2 mg)、化合物2(10.4 mg)、化合物3(9.6 mg)、化合物4(20.4 mg)、化合物5(7.6 mg)、化合物6(14.8 mg)、化合物7(17.1 mg)、化合物8(6.7 mg)、化合物9(9.8 mg)、化合物10(25.4 mg)、化合物11(10.3 mg)、化合物12(19.6 mg)。

3 化合物结构鉴定

化合物1,C18H16O8；黄色胶体;ESIMS m/z(positive ion mode)383 [M+Na]+;1H NMR data(C5D5N,500 MHz)δppm:6.69(1H,s,h-2),7.28(1H,d,J=8.8 Hz,H-6),7.70(1H,d,J=8.8 Hz,H-7),2.58(2H,t,J=7.2 Hz,H-1′),3.64(2H,t,J=7.2 Hz,H-2′),3.82(3H,s,1-OMe),4.12(3H,s,3′-OMe),12.29(1H,s,Ar-OH-4),12.67(1H,s,Ar-OH-5);13C NMR data (C5D5N,125 MHz)δppm: 154.0(s,C-1),107.0(d,C-2),140.0(s,C-3),140.2(s,C-4),156.8(s,C-5),120.9(d,C-6),124.9(d,C-7),127.0(s,C-8),182.0(s,C-9),146.3(s,C-4a),120.3(s,C-8a),110.0(s,C-9a),148.5(s,C-10a),37.3(t,C-1′),64.0(t,C-2′),170.0(s,C-3′),60.0(s,1-OMe),52.2(q,3′-OMe).以上数据与文献[6]报道的数据基本一致，故鉴定化合物为4,5-二羟基-3-羟乙基-1-甲氧基-8-甲酯基口山酮。

化合物2,C16H14O6; 黄色胶体; ESIMS m/z (positive ion mode) 325 [M+Na]+;1H NMR data(C5D5N,500 MHz)δppm: 7.39(1H,d,J=8.3 Hz,H-6),6.90(1H,d,J=8.3 Hz,H-5),6.62(1H,d,J=8.3 Hz,H-7),6.65(1H,s,H-2),3.54(2H,t,J=7.2 Hz,H-2′),2.60(2H,t,J=7.2 Hz,H-1′),3.96(3H,s,1-OMe),13.75(1H,s,Ar-OH-8),12.68(1H,s,Ar-OH-1);13C NMR data (C5D5N,125 MHz)δ ppm: 163.2(s,C-1),99.4(d,C-2),161.5(s,C-3),109.8(s,C-4),110.9(d,C-5),137.2(d,C-6),107.5(d,C-7),162.9(s,C-8),181.8(s,C-9),155.8(s,C-4a),108.7(s,C-8a),104.6(s,C-9a),158.3(s,C-10a),34.8(t,C-1′),64.5(t,C-2′),56.2(s,1-OMe)。以上数据与文献[7]报道的数据基本一致，故鉴定化合物为1,8-二羟基-4-羟乙基-3-甲氧基口山酮。

化合物3,C17H14O7;黄色胶体；ESIMS m/z (positive ion mode) 353 [M+Na]+;1H NMR data(C5D5N,500 MHz)δppm: 7.57(1H,d,J=8.2 Hz,H-7),7.55(1H,d,J=8.2 Hz,H-8),7.32(1H,d,J=1.8 Hz,H-4),7.21(1H,d,J=1.8 Hz,H-2),3.75(2H,t,J=7.2 Hz,H-2′),2.45(2H,t,J=7.2 Hz,H-1′),4.27(3H,s,3′-OMe),12.46(1H,s,Ar-OH-5),12.46(1H,s,Ar-OH-1);13C NMR data (C5D5N,125 MHz)δ ppm: 164.2(s,C-1),107.5(d,C-2),148.6(s,C-3),104.5(d,C-4),155.0(s,C-5),120.0(s,C-6),125.4(d,C-7),120.8(d,C-8),181.8(s,C-9),156.2(s,C-4a),124.4(s,C-8a),118.3(s,C-9a),152.6(s,C-10a),36.4(t,C-1′),63.6(t,C-2′),168.2(s,C-3′),52.4(s,3′-OMe)。以上数据与文献[8]报道的数据基本一致，故鉴定化合物为1,5-二羟基-3-羟乙基-6-甲酯基口山酮。

化合物4,C18H16O7；黄色胶体,ESIMS m/z367.0802[M+Na]+(calcdC18H16NaO7for367.0794);1H NMR data(C5D5N,500 MHz)δppm: 7.72(1H,d,J=8.2 Hz,H-7),7.63(1H,d,J=8.2 Hz,H-8),7.46(1H,d,J=1.8 Hz,H-4),7.53(1H,d,J=1.8 Hz,H-2),3.82(2H,t,J=7.2 Hz,H-2′),2.67(2H,t,J=7.2 Hz,H-1′),4.23(3H,s,3′-OMe),3.75(3H,s,1-OMe),12.75(1H,s,Ar-OH-5);13C NMR data(C5D5N,125 MHz)δppm: 164.1(s,C-1),107.0(d,C-2),148.5(s,C-3),104.2(d,C-4),154.7(s,C-5),119.0(s,C-6),126.0(d,C-7),120.0(d,C-8),182.8(s,C-9),155.4(s,C-4a),124.6(s,C-8a),118.0(s,C-9a),152.8(s,C-10a),36.0(t,C-1′),63.8(t,C-2′),168.0(s,C-3′),56.0(q,1-OMe),52.8(q,3′-OMe)。以上数据与文献[8]报道的数据基本一致，故鉴定化合物为1-羟基-5-甲氧基-3-羟乙基-6-甲酯基口山酮。

化合物5,C17H14O6；黄色胶体,ESIMS m/z (positive ion mode) 337 [M+Na]+;1H NMR data(C5D5N,500 MHz)δppm: 7.84(1H,d,J=8.2 Hz,H-7),7.62(1H,t,J=8.2 Hz,H-6),7.39(1H,d,J=8.2 Hz,H-5),7.22(1H,d,J=1.8 Hz,H-4),7.09(1H,d,J=1.8 Hz,H-2),3.69(2H,t,J=7.2 Hz,H-2′),2.68(2H,t,J=7.2 Hz,H-1′),4.14(3H,s,3′-OMe),12.41(1H,s,Ar-OH-5);13C NMR data(C5D5N,125 MHz)δppm: 161.9(s,C-1),109.5(d,C-2),148.7(s,C-3),104.4(d,C-4),119.5(d,C-5),130.6(d,C-6),122.7(d,C-7),134.6(s,C-8),181.9(s,C-9),156.8(s,C-4a),117.9(s,C-8a),109.0(s,C-9a),154.9(s,C-10a),36.7(t,C-1′),64.2(t,C-2′),170.3(s,C-3′),53.4(q,3′-OMe)。以上数据与文献[8]报道的数据基本一致，故鉴定化合物为1-羟基-3-羟乙基-8-甲酯基口山酮。

化合物6,C18H14O6；黄色胶体; ESIMS m/z (positive ion mode) 365 [M+Na]+;1H NMR data(C5D5N,500 MHz)δppm: 7.51(1H,d,J=8.2 Hz,H-7),7.39(1H,d,J=8.2 Hz,H-8),7.00(1H,d,J=2.2 Hz,H-4),6.98(1H,d,J=2.2 Hz,H-2),1.38(3H,s,H-3′),2.47(2H,s,H-1′),4.43(3H,s,4′-OMe),12.62(1H,s,Ar-OH-5),12.09(1H,s,Ar-OH-1);13C NMR data (C5D5N,125 MHz)δppm: 163.8(s,C-1),108.8(d,C-2),144.5(s,C-3),106.2(d,C-4),155.0(s,C-5),119.0(s,C-6),126.4(d,C-7),120.0(d,C-8),182.0(s,C-9),156.6(s,C-4a),125.0(s,C-8a),119.0(s,C-9a),152.0(s,C-10a),49.0(t,C-1′),205.9(s,C-2′),30.4(q,C-3′),169.2(s,C-4′),52.1(q,4′-OMe)。以上数据与文献[9]报道的数据基本一致，故鉴定化合物为1,5-二羟基-3-乙酸甲酯基-6-甲酯基口山酮。

化合物7,C18H14O6; 黄色胶体; ESIMS m/z (positive ion mode) 353[M+Na]+;1H NMR data(C5D5N,500 MHz)δppm: 7.69(1H,d,J=8.2 Hz,H-7),7.56(1H,t,J=8.2 Hz,H-6),7.43(1H,d,J=8.2 Hz,H-5),7.09(1H,d,J=2.2 Hz,H-4),6.89(1H,d,J=2.2 Hz,H-2),2.24(2H,s,H-1′),1.46(3H,s,H-3′),4.24(3H,q,4′-OMe),12.36(1H,s,Ar-OH-1);13C NMR data(C5D5N,125 MHz)δppm: 163.0(s,C-1),110.2(d,C-2),144.1(s,C-3),105.9(d,C-4),120.2(d,C-5),130.1(d,C-6),122.0(d,C-7),133.9(s,C-8),180.0(s,C-9),157.0(s,C-4a),116.9(s,C-8a),108.1(s,C-9a),155.0(s,C-10a),50.1(t,C-1′),206.0(s,C-2′),30.5(q,C-3′),170.2(s,C-4′),53.0(q,4′-OMe)。以上数据与文献[9]报道的数据基本一致，故鉴定化合物为1-羟基-3-乙酸甲酯基-8-甲酯基口山酮。

化合物8,C18H18O9;黄色胶体,ESIMS (positive ion mode):m/z401 [M+Na]+;1H NMR data(C5D5N,500 MHz)δppm: 7.33(1H,d,J=8.8 Hz,H-6),6.62(1H,d,J=8.8 Hz,H-7),6.42(1H,s,H-2),4.53(1H,m,H-2′),4.20,4.30(2H,m,H-4′),3.91(1H,m,H-1′),3.39,3.42(2H,m,H-3′),3.89(3H,s,OMe-3);13C NMR data(C5D5N,125 MHz)δppm: 155.4(s,C-1),100.1(d,C-2),160.2(s,C-3),130.0(s,C-4),123.1(s,C-5),135.0(d,C-6),110.1(d,C-7),161.9(s,C-8),181.9(s,C-9),153.1(s,C-4a),109.8(s,C-8a),106.1(s,C-9a),155.0(s,C-10a),43.1(d,C-1′),73.5(d,C-2′),69.3(t,C-3′),63.5(t,C-4′),56.4(q,OMe-3)。以上数据与文献[7]报道的数据基本一致，故鉴定化合物为1,4,8-三羟基-3-甲氧基-5-丁三醇基口山酮。

化合物9,C18H18O9；黄色胶体,ESIMS (positive ion mode):m/z401 [M+Na]+;1HNMR data(C5D5N,500 MHz)δppm: 7.52(1H,d,J=8.8 Hz,H-6),6.95(1H,d,J=8.8 Hz,H-7),6.53(1H,s,H-2),4.84(1H,m,H-2′),4.19,4.36(2H,m,H-4′),4.20(1H,m,H-1′),3.46,3.51(2H,m,H-3′),3.83(3H,s,OMe-3),14.27(1H,s,Ar-OH-4),13.94(1H,s,Ar-OH-1),13.73(1H,s,Ar-OH-3);13CNMR data(C5D5N,125 MHz)δppm: 156.2(s,C-1),101.2(d,C-2),157.3(s,C-3),131.2(s,C-4),121.0(s,C-5),135.0(d,C-6),106.9(d,C-7),166.2(s,C-8),182.1(s,C-9),153.2(s,C-4a),111.2(s,C-8a),106.1(s,C-9a),156.2(s,C-10a),42.3(d,C-1′),73.1(d,C-2′),66.2(t,C-3′),61.0(t,C-4′),60.9(q,OMe-8)。以上数据与文献[7]报道的数据基本一致，故鉴定化合物为1,3,4-三羟基-8-甲氧基-5-丁三醇基口山酮。

化合物10,C20H20O9; 黄色胶体; ESIMS m/z (positive ion mode) 427 [M+Na]+;1H NMR data(C5D5N,500 MHz)δppm: 6.89(1H,s,H-4),6.76(1H,s,H-5),6.72(1H,s,H-7),6.64(1H,s,H-2),5.13(1H,m,H-2′),4.54,4.59(2H,m,H-3′),4.40(1H,m,H-1′),4.10,4.21(2H,m,H-4′),3.78(3H,s,OMe-1),4.3(3H,s,OMe-5′),12.79(1H,s,Ar-OH-6);13CNMR data(C5D5N,125 MHz)δppm: 163.8(s,C-1),109.0(d,C-2),150.2(s,C-3),104.4(d,C-4),103.8(d,C-5),165.6(s,C-6),114.1(d,C-7),137.5(s,C-8),182.4(s,C-9),156.4(s,C-4a),110.2(s,C-8a),108.2(s,C-9a),159.1(s,C-10a),42.8(d,C-1′),72.9(d,C-2′),67.1(t,C-3′),63.4(t,C-4′),170.2(s,C-5′),56.3(q,OMe-1),53.0(q,OMe-5′)。以上数据与文献[7]报道的数据基本一致，故鉴定化合物为6-羟基-1-甲氧基-8-甲酯基-3-丁三醇基口山酮。

化合物11,C21H22O10;黄色胶体; ESIMS m/z (positive ion mode) 457 [M+Na]+;1H NMR data(C5D5N,500 MHz)δppm: 7.32(1H,s,H-7),6.98(1H,s,H-4),6.54(1H,s,H-2),5.26(1H,m,H-2′),4.74,4.82(2H,m,H-3′),4.53(1H,m,H-1′),4.21,4.26(2H,m,H-4′),3.80(3H,s,OMe-1),4.2(3H,s,OMe-5′),3.84(3H,s,OMe-6),3.76(3H,s,OMe-5),13.4(1H,s,Ar-OH-1);13CNMR data (C5D5N,125 MHz)δppm: 162.2(s,C-1),107.9(d,C-2),148.6(s,C-3),105.8(d,C-4),147.2(s,C-5),152.5(s,C-6),106.4(d,C-7),130.5(s,C-8),182.5(s,C-9),155.2(s,C-4a),111.0(s,C-8a),108.0(s,C-9a),145.5(s,C-10a),42.9(d,C-1′),72.5(d,C-2′),66.2(t,C-3′),63.4(t,C-4′),171.1(s,C-5′),61.0(q,OMe-5),56.5(q,OMe-6),52.8(q,OMe-5′)。以上数据与文献[7]报道的数据基本一致，故鉴定化合物为1-羟基-5,6-二甲氧基-8-甲酯基-3-丁三醇基口山酮。

化合物12,C21H22O10;黄色胶体; ESIMS m/z (positive ion mode) 457 [M+Na]+;1H NMR data(C5D5N,500 MHz)δppm: 7.76(1H,d,J=8.8,H-7),7.44(1H,d,J=8.8,H-6),6.82(1H,s,H-2),5.31(1H,m,H-2′),4.64,4.78(2H,m,H-3′),4.39(1H,m,H-1′),4.26,4.18(2H,m,H-4′),3.71(3H,s,OMe-1),3.82(3H,s,OMe-4),4.52(3H,s,OMe-5′),13.17(1H,s,Ar-OH-5);13CNMR data (C5D5N,125 MHz)δppm: 155.0(s,C-1),106.4(d,C-2),130.1(s,C-3),145.2(s,C-4),155.0(s,C-5),122.0(d,C-6),125.3(d,C-7),126.0(s,C-8),182.1(s,C-9),147.1(s,C-4a),120.0(s,C-8a),108.2(s,C-9a),148.0(s,C-10a),41.5(d,C-1′),72.8(d,C-2′),66.0(t,C-3′),62.0(t,C-4′),170.1(s,C-5′),56.0(q,OMe-1),61.5(q,OMe-4),53.2(q,OMe-5′)。以上数据与文献[7]报道的数据基本一致，故鉴定化合物为5-羟基-1,4-二甲氧基-8-甲酯基-3-丁三醇基口山酮。

4 结果与讨论

(1)从滇重楼内生真菌YNCY0884菌株分离得到12个口山酮类化合物，分别为：4,5-二羟基-3-羟乙基-1-甲氧基-8-甲酯基口山酮、1,8-二羟基-4-羟乙基-3-甲氧基口山酮、1,5-二羟基-3-羟乙基-6-甲酯基口山酮、1-羟基-5-甲氧基-3-羟乙基-6-甲酯基口山酮、1-羟基-3-羟乙基-8-甲酯基口山酮、1,5-二羟基-3-乙酸甲酯基-6-甲酯基

口山酮、1-羟基-3-乙酸甲酯基-8-甲酯基口山酮、1,4,8-三羟基-3-甲氧基-5-丁三醇基口山酮、1,3,4-三羟基-8-甲氧基-5-丁三醇基口山酮、6-羟基-1-甲氧基-8-甲酯基-3-丁三醇基口山酮、1-羟基-5,6-二甲氧基-8-甲酯基-3-丁三醇基口山酮、5-羟基-1,4-二甲氧基-8-甲酯基-3-丁三醇基口山酮。

(2)从化合物鉴定结果可知滇重楼内生真菌不同菌株中含有相同代谢产物，这可能跟寄生同一宿主有关，相同的宿主植物能为内生菌提供相同的生存环境。

(3)本实验采取固体发酵，固体发酵具有发酵周期短，代谢物常量高，发酵成本低、易操作等特点。