王 杰，王晓华，武丽琼，刘雅贤，郭志远，梁 庄，侯丽青，贾跃旗△

1.内蒙古自治区妇幼保健院遗传优生科，内蒙古呼和浩特 010010；2.内蒙古大学省部共建草原家畜生殖调控与繁育国家重点实验室，内蒙古呼和浩特 010021；3.内蒙古自治区妇幼保健院超声医学科，内蒙古呼和浩特 010010

近年来，随着分子遗传学技术的迅速发展，无创产前基因检测(NIPT)技术在临床上受到了越来越广泛的关注。作为一项优秀的产前筛查工具，NIPT技术具有无创、高精度等诸多优势。它主要通过检测孕妇外周血浆中的胎儿游离DNA(cffDNA)，对21、18、13-三体和性染色体非整倍体(SCAs)进行筛查，大大提高了这几种染色体病的检出率。但是，在这项技术的背后，限制性胎盘嵌合(CPM)一直是困扰大家的难题。CPM是指胎盘内同时存在两种或多种细胞系，其染色体核型与胎儿存在差异，胎儿染色体核型大多正常。早孕期绒毛活检(CVS)中CPM 的发生率为1%～2%[1-2]，其中30%～50%的CPM会在妊娠过程中丢失胎盘非整倍体细胞系[3]。而在异常细胞持续存在的病例中，CPM可能会增加不良妊娠结局的风险[4]。本研究对在内蒙古自治区妇幼保健院进行NIPT检测阳性的孕妇进行产前诊断，并在引产或生育后取胎盘组织进行荧光原位杂交技术(FISH)或染色体微阵列分析(CMA)检测，评估CPM对NIPT结果的影响。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2016-2018年在内蒙古自治区妇幼保健院产前诊断中心经NIPT检测后，结果提示高风险的孕妇，经产前诊断，在孕妇知情同意的情况下于终止妊娠或足月生产后采集16例胎盘标本。本研究经内蒙古自治区妇幼保健院伦理委员会批准。

1.2方法

1.2.1NIPT检测 抽取孕妇外周静脉血5 mL，置于cffDNA专用真空采血管(康为世纪)中，分别以1 600×g及16 000×g低温离心10 min后得到血浆标本。按王杰等[5]报道的方法提取血浆游离DNA并制备文库，DNA文库经质控后达到290 bp左右的片段峰值，水平>30 nmol/L。借助于BGI500测序平台进行测序，利用高分辨率成像系统及生物信息系统转换得待测序列。所得序列经与人参考基因组GRCh37/hg19比对确定每一测序reads染色体的定位，计算得出标准化Z值。标本满足质量控制标准(有效数据量≥3.5 Mb，无扩增偏倚，cffDNA比例≥3.5%)时根据标准化Z值评估检测结果，若Z值的绝对值≥3，提示为高风险；Z值介于-3～<3，结果为低风险。

1.2.2羊水细胞培养及染色体制备 按照实验室标准流程进行培养、制片、染色等，根据人类细胞基因组学国际命名体系标准(2020)进行核型分析诊断。

1.2.3胎盘组织的采集 孕妇终止妊娠或足月生产后排出胎盘，分别取胎盘边缘、胎盘中央近胎儿面、胎盘近脐带根部母体面组织各2 cm×2 cm，浸泡于装有无菌PBS的离心管中，-80 ℃冰箱保存。

1.2.4FISH检测 (1)样品载玻片预处理：羊水细胞经离心、低渗后滴片固定于载玻片，胎盘组织标本剪碎、60%冰乙酸吹打固定于载玻片，固定好的玻片标本经SSC溶液洗涤和胃酶处理，预冷的乙醇溶液固定，将核酸暴露。(2)变性：将玻片和探针分别在变性剂中76 ℃变性。玻片变性后经预冷的乙醇溶液固定，待其干燥后，置于60 ℃烤片机上预热。(3)杂交：将变性后的探针滴于玻片杂交区，加盖盖玻片，封胶，在封闭的湿盒中37 ℃过夜杂交。(4)洗涤：将杂交后的玻片置于变性液中洗涤，洗脱未特异杂交的探针，再用70%乙醇溶液中固定。(5)镜检：将洗涤后的玻片经DAPI复染剂染色，在荧光显微镜下镜检。(6)结果判读：镜下进行细胞计数。每个杂交区至少计数50个信号强且无重叠的杂交细胞。如果超过90%的细胞显示非整倍信号，则判断为非整倍体；如果10%～60%的细胞显示非整倍体信号，则可能为嵌合体；如果信号差无法确定则加大细胞计数至100个。所有标本均在盲法设计下，与染色体核型分析比较。

1.2.5CMA检测 应用Affymetrix公司的CytoScan HD全基因芯片扫描技术检测全基因组拷贝数变异(CNVs)。标本依次进行PCR扩增、提纯、定量、片段化处理，再将DNA溶液标记后加入杂交试剂孵育，载入到芯片中进行杂交反应；洗染芯片后用Affymetrix GeneChip Scaner扫描分析，通过AGCC软件芯片图像显示分析生成原始cel文件，并利用CHAS软件分析结果[5]。检测到的CNVs与基因组数据(GRCh37/hg19)进行比对，借助于UCSC、DECIPHER、ISCA CNVs多态性数据库、既往文献及在线人类孟德尔遗传数据库(OMIM)，对其临床意义进行系统的评估和判断，并按照人类细胞基因组学国际命名体系标准(ISCN2020)进行结果描述。

2 结 果

2.1NIPT高风险产前诊断、胎盘检测结果 16例NIPT高风险且采集到胎盘的研究标本包含21-三体高风险13例，经产前诊断后12例与NIPT结果一致，引产后对胎盘组织进行FISH/CMA检测，结果与NIPT一致。1例产前诊断后胎儿染色体核型未见异常(标本1)，与NIPT检测结果不一致；NIPT提示18-三体高风险2例，经产前诊断及胎盘检测后均与NIPT结果一致；NIPT提示 6号染色体三体高风险1例(标本2)，抽取羊水进行CMA产前诊断后结果提示胎儿16号染色体存在部分缺失：arr[GRCh37]16p13.11(14892975_16528123)×1，与NIPT检测结果不一致，该区域覆盖了16p13.11微缺失综合征的全部区域。

经统计，NIPT结果与产前诊断结果的一致率为87.5%(14/16)，与胎盘检测结果的一致率为93.8%(15/16)。其中NIPT提示21-三体高风险与产前诊断结果的一致率为92.3%(12/13)，与胎盘检测结果的一致率为100.0%(13/13)；NIPT提示18-三体高风险与产前诊断结果的一致率为100.0%(2/2)，与胎盘检测的一致率为100.0%(2/2)；NIPT提示6号染色体三体高风险与产前诊断检测、胎盘检测结果均存在偏差。

2.22例NIPT假阳性标本胎盘检测及孕期回顾性分析 2例标本NIPT假阳性标本，分别在生育或引产后取胎盘组织进行CMA检测。其中，标本1孕妇(24岁)NIPT提示21-三体高风险，孕期经羊水核型分析检测胎儿核型未见异常(46，XN)。足月分娩后，胎盘多点CMA检测存在不同比例的嵌合，胎盘边缘区域检测结果为arr(21)×3[0.4]；胎盘中央近胎儿面为arr(21)×3[0.33]；胎盘近脐带根部母体面为arr(21)×3[0.25]。对其孕期情况进行回顾分析，该孕妇孕期平顺，超声影像学检测胎儿生长发育未见明显异常。足月择期子宫下段剖宫产术终止妊娠，产一男婴，新生儿出生体质量3.2 kg，外观无明显畸形。

标本2孕妇(32岁)NIPT提示6号染色体三体高风险，经羊水CMA基因芯片检测后提示胎儿16号染色体存在部分缺失：arr[GRCh37]16p13.11(14892975_16528123)×1。引产后留取胎盘组织经CMA检测后提示存在6号染色体三体嵌合与16p13.11区域部分缺失，其中胎盘边缘区为arr(6)×3[0.25]；胎盘中央近胎儿面区为arr[GRCh37](6)×3[0.52],16p13.11(14892975_16528123)×1；胎盘近脐带根部母体面为arr(6)×3[0.4]。对其孕期情况进行回顾，孕早期胎儿颈项透明层(NT)超声检测未见异常,但孕中期出现胎儿宫内生长受限，影像学检查提示胎儿双顶径头围相当于25+5周，腹围相当于24周，股骨、肱骨相当于22+5周，23+3周时，股骨肱骨<2s，双侧肾盂分离，分别为左侧宽0.53 cm、右侧宽0.51 cm(图1)。引产后，胎儿外观无其他明显畸形。孕妇及其配偶进行外周血CMA分析，未见异常。

图1 标本2胎儿双肾超声横切面图

3 讨 论

NIPT技术自开展以来在全世界范围内得到了广泛的使用，尽管得到了很高的认可，但是它仍然是一项筛查技术，还不能完全取代产前诊断技术。影响NIPT结果的原因主要来源于母体因素或者胎儿因素，母体因素包括母体本身染色体异常、恶性肿瘤、移植男性器官、组织，胎儿因素包括cffDNA偏低、胎盘嵌合体及双胎之一消失[1]。由于NIPT技术主要检测的是母体血浆中cffDNA，而cffDNA主要来源于胎盘绒毛外层凋亡的滋养层细胞，进入母亲外周血液循环，因此胎盘嵌合体会直接影响NIPT结果。

在CPM中胎盘多同时存在两种或多种细胞系，其染色体核型与胎儿存在差异，此时胎儿染色体核型大多正常，这种情况就会导致NIPT假阳性[1,6]。GRATI等[7]对52 673例CVS标本的回顾性分析发现，在不同胎盘嵌合类型中都会存在一定比例的13-三体、18-三体和21-三体。随着大家研究的深入，CPM对NIPT检测影响的病例陆续增加。谢润桂等[8]对86例NIPT假阳性病例进行母血和胎盘的检测，得出胎盘和母血中异常的游离DNA释放是NIPT假阳性的主要原因。高雅等[9]报道了1例由于21-三体CPM造成的NIPT假阳性，同时指出羊水穿刺过程中胎盘或胎盘滋养层细胞污染可能引起产前诊断的假阳性。李萌萌等[10]也报道1例由于胎盘存在2-三体、7-三体及21-三体嵌合引起NIPT假阳性的案例，该孕妇在28周时出现胎儿宫内生长发育迟缓，孕妇本人于37周出现子痫的表现。本研究通过对羊水细胞和胎盘组织的检测，发现NIPT结果与产前诊断的一致率为87.5%，但是与胎盘检测结果的一致率可达93.8%。其中NIPT提示的21-三体的高风险与产前诊断结果的一致率为92.3%(12/13)，胎盘检测与NIPT结果的一致率为100.0%(13/13)；18-三体的产前诊断与NIPT结果的一致率为100.0%(2/2)，胎盘检测与NIPT结果的一致率为100.0%(2/2)；6号染色体三体的产前诊断检测、胎盘检测与NIPT结果均存在偏差。

本研究有2例NIPT假阳性标本。其中标本1 NIPT提示21-三体高风险，产前诊断后胎儿染色体核型未见异常。该孕妇孕期平顺，超声影像学检测胎儿生长发育未见明显异常。后足月择期子宫下段剖宫产术终止妊娠，产一男婴，新生儿出生体质量3.2 kg，外观无明显畸形。胎儿出生后多点胎盘检测后存在不同比例的21-三体嵌合。标本2 NIPT提示 6号染色体三体高风险，抽取羊水进行CMA产前诊断，提示胎儿存在16p13.11部分缺失。已报道携带有相同片段缺失的患者主要表现包括中度/重度智力障碍、癫痫、发育迟缓、前脑无裂畸形、小头畸形、特殊面容、拇指外翻等[11]。本例受检者在孕中期出现胎儿宫内生长受限，影像学检查提示胎儿双顶径头围相当于25+5周，腹围相当于24周，股骨、肱骨相当于22+5周，23+3周时，股骨肱骨<2s，双侧肾盂分离，分别为左侧宽0.53 cm、右侧宽0.51 cm。孕妇充分知情，被告之后选择引产，引产后取胎盘组织进行CMA检测，结果提示6号染色体三体嵌合与16p13.11存在1.36M部分缺失。2例经产前诊断结果显示NIPT假阳性，胎儿染色体核型和胎盘结果不一致。标本2孕妇的胎盘多点标本CMA检测为6号染色体三体与16号染色体微缺失的嵌合，与胎儿的染色体核型结果不一致，证实本例孕妇胎盘存在CPM。该孕妇在孕25周出现胎儿生长受限，推测是CPM导致的[12-14]。标本1孕妇胎儿孕期生长发育良好，可能是由于胎盘中异常细胞比例较低，对胎儿血液供应影响较小所致。进一步说明CPM是引起NIPT结果与产前诊断结果不一致的重要原因，因此对于NIPT高风险的孕妇建议通过侵入性诊断来进一步明确诊断，不能单纯基于NIPT结果来决定终止妊娠。

综上所述，由于NIPT检测存在假阳性及假阴性等局限性，对于高风险的孕妇需进行产前诊断以明确诊断。对于检测结果高度提示为CPM的孕妇，妊娠期应加强对胎儿在宫内发育情况的监测，当出现胎儿生长受限时，对脐动脉血流及大脑中动脉血流进行检测，并在后续分娩时留取胎盘标本，以明确胎盘染色体核型的诊断。