杨蕾　洪林　张云贵等

中图分类号：S 436. 66 文献标识码：A DOI：10.16688/j.zwbh 2020232

重庆具有悠久的柑橘种植历史，是世界柑橘生产最适宜地区之一。柑橘产业位居重庆市特色水果产业之首，是助推重庆市精准脱贫和实施乡村振兴行动的重要支柱产业之一。至2019年底全市柑橘种植面积约23. 33万hm²，产量超320万t，总产值近300亿元，实现了柑橘种植面积和产量的连续13年增长。品种作为重庆市柑橘产业发展的第一要素，现有种类较为齐全，主要由甜橙、杂柑、宽皮橘、柚、柠檬五大类组成，其中甜橙、杂柑两大类的种植面积和产量分别约占总量的60%和63%。重庆生态条件独特，小气候特点鲜明，夏季炎热冬季湿寒、寡日照时间长、无霜期长、雨量充沛。这种气候特点使得多种病虫害在橘园内普遍发生。而柑橘青苔就是一种受气候影响极大且发生普遍、危害严重的病害。青苔滋生会阻碍柑橘的光合作用，导致柑橘树势衰退，造成果实品质下降，严重影响柑橘果实商品性。

复合侵染由2种、3种乃至更多种病原物共同引起，大豆、烟草、番茄、黄瓜、芒果等等多种植物上都存在因病原物复合侵染引起的病害。有学者研究认为柑橘青苔的病原是虚幻球藻Apatococcus lo-batus和胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeospori-oides，而近期研究表明，柑橘青苔是由多种藻类和病原真菌复合侵染造成的。病原侵染寄主后，寄主内的生物群落结构会有明显的变化。柑橘青苔可能的主要病原生物的相对丰度随病情等级的增加逐渐升高。在柑橘感染黄龙病后有病症组中的Candidatus Liberibacter asiaticus的含量是无病症组的200倍，从而确定C.Liberibacter asiaticus对黄龙病起关键作用。在病程的不同阶段，寄主的内生菌多样性存在显著差异。

作物病害生态系统（crop disease ecosystem）是農业生态系统中的一个子系统，主要由寄主、病原物及其所处的环境构成，系统中的寄主抗病性、病原物毒性和环境（包括人的活动）三者之间的相互作用，组成了不同的病害水平。总的来说不同寄主植物的抗病机理有3种：形态结构方面的物理抗病性（physical resistance）、生理生化方面的化学抗病性（chemical resistance）以及两者相互作用的共同抗病性。从植物微生态角度分析，植物微群落中，微种群数量越多则多样性越高，植物生态系统的功能与结构越稳定，越不易感病。植物病原真菌普遍存在，并且它们可以影响植物生理、生长和产出。与此相对的，病原的传播和侵染也会受到植物群落特征的调控：比如增加植物品种多样性和地域多样性可以降低病原的侵染力。在土耳其的不同地区不同栽培品种中引发橄榄黄萎病的病原类群有显著差异，并且它们造成的病症及发病程度也不相同。在病原菌与寄主的协同作用中，病原有着复杂的再生系统，它会受到地域和品种的共同作用，同时研究表明病原菌群落结构的多样性和寄主在时间空间上的抗性有很强的相关性。有些病害病原菌的致病力和群落结构等受地域的影响大于品种对它的影响，如在葡萄牙阿尔加韦地区橄榄炭疽病的病原群落结构特征和葡萄牙其他地区或是世界其他地方的有明显不同，并且在这个特定区域不论是野生种、地方种还是新栽培种的病原构成相似度均较高。也有研究表明，寄主品种及其周围环境中的其他物种类型会对病原产生影响：在农田生态系统中，寄主与病原的互作关系不仅与寄主植物本身有关，还与本土环境中存在的其他物种有关;在森林中树木种类的多样性越丰富则病原的丰度和侵染力会越低，同时寄主植物比例对病原的影响不显著而非寄主植物对病原有强烈的影响。

为了解不同区域和不同品种柑橘叶际生物的群落特征，探寻不同条件下有青苔病症和无病症柑橘叶片叶际真核生物群落多样性和群落结构的差异，我们通过高通量测序的方法对重庆2个区县6个品种的柑橘叶片进行了叶际真核生物多样性分析，以期明确地域和品种是否会对柑橘青苔病原类型产生影响，从而为针对性进行柑橘青苔病防治提供一定的理论依据。

1材料和方法

1.1试验材料和采样地点

以3个甜橙品种‘塔罗科血橙‘纽荷尔‘卡拉卡拉红肉脐橙（简称卡拉卡拉）和3个杂柑品种‘沃柑‘春见‘W·默科特为研究对象，在忠县和开州选择管理水平相似、海拔相近的果园分别采集6个品种有病症和无病症的柑橘叶片样品共24份。样品信息见表1。

1.2真核生物基因组DNA提取及质量检测

柑橘叶片不经前处理直接用天根组织DNA提取试剂盒抽提柑橘叶表真核生物的基因组DNA，用Nanodrop 2000检测基因组DNA质量。要求浓度≥10ng/μL，总量≥500 ng，纯度OD₂₆₀/OD₂₈₀=1.7～2.0。取3μL质量合格的基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测，电压为120 V，电泳时间约为20 min，利用凝胶成像系统拍照观察DNA样品的完整性。

1.3柑橘叶际真核生物基因组DNA扩增及纯化

以提取的24份柑橘叶表样本基因组DNA 为模板对其18SrRNA 的V4区进行高保真PCR扩增。PCR 反应体系（10μL）为10×Top狋犪狇Buffer1μL，dNTPs0.8μL，上、下游引物各0.2μL，DNA 模板2μL，DNA 聚合酶0.2μL，补充ddH2O 至10μL。反应程序：94℃2min;94℃20s，55℃ 30s，72℃1min，25个循环;72℃延伸10min。设置3个重复，同时以胶孢炭疽菌基因组DNA 作为阳性对照。扩增引物根据18SrRNA V4检测区域确定，具体序列为：EK NSF573：5′CGCGGTAATTCCAGCTCCA3′，EK NSR951：5′TTGGYRAATGCTTTCGC3′。琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物是否单一和特异。将

1.4序列数据处理与统计分析

利用FastQC评估原始数据的质量指标，通过FASTX-Toolkit对所得数据进行质量控制，剔除未识别碱基和低质量序列。使用FLASH（version 1.0.0）程序进行拼接，用FASTX-Toolkit软件将有barcode标记的引物从混合样品中分离。使用UChime（version USEARCH 5.2.32）去除嵌合序列。计算DNA矩阵，运用UPARSE程序在97%的序列相似度水平下对序列进行OTU划分。RDP-Classifer软件分析设置置信度参数为50%。一般认为遗传距离小于3%的序列对应微生物属于同一物種。用R语言vegan程序包完成多样性分析，其中用线性判别分析|LDA|>2且P<0. 05作为阈值评估差异显著的物种的效应值，得到组间丰度有显著差异的物种，并对结果进行可视化展示。

采用IBM SPSS Statics 21软件对所测数据进行单因素方差分析，用平均值和标准误表示测定结果，并应用Duncan氏新复极差法对不同处理间的差异显著性进行检验（P<0.05）。

2结果与分析

2.1柑橘叶际真核生物群落基本组成

24份柑橘叶片样本共获得3916 232条高质量序列片段，总碱基数为1 350 500 811个，平均长度为344. 85 bp，共检测到491个OTUs。在生物多样性和群落调查中，稀释曲线（rarefaction curve）被广泛用于判断样品量是否充分以及估计物种丰富度。从图1可以看出，24份样品对应的稀释曲线均基本趋于平缓，测序深度基本符合后续分析要求，实际环境中真核生物群落结构的置信度较高，能够比较真实地反映出样品的群落特征。从物种注释统计表（表2）可以看出，开州无病症‘塔罗科血橙组（KTN）鉴定到的真核生物类型最多，有179个门、173个纲、165个目、140个科、182个属、207个种，而开州无病症‘W.默科特组（KWN）的真核生物种类最少，有86个门，78个纲、73个目、56个科、77个属、87个种;总体上两地区6个品种的有病症组的真核生物种类数量明显多于无病症组。

2.2柑橘叶际真核生物群落结构

从不同分类水平下的多样本物种组成图（图2）可以看出，优势门包含链形植物门Streptophyta、子囊菌门Ascomycota、绿藻门Chlorophyta和担子菌门Basidiomycota，其中链形植物门主要是寄主植物柑橘的序列;优势纲包含座囊菌纲Dothideomycetes、共球藻纲Trebouxiophyceae、散囊菌纲Eurotiomycetes、子囊菌纲Sordariomycetes等;优势目包含煤炱目Capnodiales、格孢菌目Pleosporales、刺盾炱目Chaetothyriales、小球藻目Chlorellales等;优势科包括Cladosporiaceae、Phaeosphaeriaceae、Trichomeriaceae、锁掷酵母科Sporidiobolaceae、小球藻科Chlorellaceae等;优势属包含枝孢菌属Cladosporium、橡胶藻属Heveochlorella、杯梗孢属Cyphellophora、Parast-agonospora、Knufia等;优势种包含Cladosporiumherbarum、Sporidiobolus pararosus、Knufia petrico-la、Heveochlorella hainangensis、Parastagonosporaavenae、Cyphellophora sessilis等。

将所有样本中相对丰度大于1%的物种绘制物种总丰度柱状图（图3），该图显示了在种分类水平下，所有样本中整体丰度较高的物种及其相对丰度。结果显示，除去柑橘和未知种外，共有28个种的相对丰度较高，其中相对丰度最高的3个种为C.herba-rum （12. 41%）、uncultured Apatococcus（5.41%）、S.pararoseus（4. 32%）。

2.3柑橘叶表真核生物多样性分析

2.3.1 Alpha多样性分析

Chaol指数、Shannon指数和Simpson指数是常用的描述群落物种多样性的Alpha多样性指数，这些指数可以对群落物种组成的丰富度和均匀度进行综合评价，Chaol数值越高表明群落物种的丰富度越高，Shannon值越大说明群落多样性越高，Simpson指数值越大群落多样性越低。从这些指数（表3）可以看出，柑橘叶片真核生物的多样性较为丰富，其中Chaol指数最高和最低的分别是开州无病症‘塔罗科血橙（KTN）和开州无病症‘W·默科特（KWN），Shannon指数最高和最低的分别是开州有病症‘W·默科特（KWY）和开州无病症‘W·默科特（KWN），Simpson指数最高和最低的分别是开州无病症‘W·默科特（KWN）和忠县有病症‘卡拉卡拉（ZKY）。

2.3.2组间OTU构成分析

Venn图可以统计OTU水平中多组样本中所共有或独有的物种数目，可以反映各个环境样品在物种组成上的相似性及重叠情况。共同含有的OTU数量越多说明多样品间的生物群落组成相似度越高。通过Venn图（图4）可以看出，4个不同区组柑橘叶表包含共有的真核生物OTUs是145个，2个甜橙组含有的特异OTUs个数较多，2个杂柑组含有特异OTUs个数较少，其中忠县杂柑组含特异OTUs个数最少，仅为28个。从地域来看，忠县甜橙和杂柑共有的OTUs为201个，忠县甜橙特有OTUs 105个，忠县杂柑特有OTUs 54个;开州甜橙和杂柑共有的OTUs为212个，开州甜橙特有99个OTUs，开州杂柑特有79个OTUs。从品种类型来看，两地甜橙共有OTUs为209个，杂柑共有OTUs 178个;忠县甜橙特有（OTUs 97个，开州甜橙特有（OTUs 102个;忠县杂柑特有OTUs77个，开州杂柑含有特有OTUs最多，为113个。

2.3.3样本聚类分析

样本聚类树可以从整体上描述和比较样本/分组间的相似性和差异性，越相似的两个样本会优先聚类。将上述4个分组按有病症和无病症分成两个亚组（如将A分成Al有病症组和A2无病症组）。从图5可以看出，除少数样本外，总体而言无病症组和有病症组分别聚为一类，并且同一采样区县同一种类品种也大多聚为一类。

2.3.4 Lefse分析

基于线性判别分析（LDA）的效应量判定方法（Lefse）支持高维分类比较，可用于筛选最可能解释组间差异的物种。

由图6可以看出，组间物种构成有显著差异的样本是A1（忠县甜橙有病癥组）、B2（忠县杂柑无病症组）、C1（开州甜橙有病症组）、C2（开州甜橙无病症组）、D1（开州杂柑有病症组）和D2（开州杂柑无病症组）。在A1组中与其他组的组成和丰度有显著差异的物种属于赭粉菌目Venturiales、叶黑粉菌目Entylomatales和伞型束梗孢菌目Agaricostilbales，B2组的差异物种属于担孢酵母目Erythrobasidiales、炭角菌目Xylariales、Sympoventuriaceae，C1组的差异物种属于小球藻目Chlorellales、外担菌目Exobasidiales、隔担菌目Septobasidiales，C2组的差异物种属于伞型束梗孢菌目Agaricostilbales，D1组的差异物种属于小球藻目Chlorellales、外担菌目Exobasidiales、刺盾炱目Chaetothyriales，D2组的差异物种属于Cystofilobasidiales。

2.4有病症组和无病症组之间生物组成和结构的差异

2.4.1有病症组和无病症组组成差异分析

将24份样品分为有病症组和无病症组两个组别。除柑橘和无记录的物种外，选择在种水平上丰度在前30位的物种绘制柱状图。

通过比较发现在相对丰度高的前30个物种中，有病症组各物种的相对总丰度明显高于无病症组各物种的相对总丰度（图7）。其中在有病症组中丰度显著高于无病症组的物种有：不可培养的球藻un-cultured Apatococcus、黄绿异小球藻Heteroclor-ella luteoviridis、海南橡胶藻Heveochlorella hain-angensis、无柄杯梗孢Cyphellophora sessilis、椭圆球藻Chloroidium ellipsoideum、Cryptococcus sp.CFL-2008a、胶孢炭疽菌C.gloeosporioides、盘状豪斯曼尼拉菌Hausmanniella discoidea、德克氏霉Derxomyces mrakii、Occultifur erternus等14种。由此推测，柑橘青苔病可能的病原为以上14个物种中的一个或多个。在无病症组中的丰度显著高于有病症组的物种有：锁掷酵母Sporidiobolus pararo-seus、油菜菌核病菌Sclerotinia sclerotiorum、牛蹄菌Moesziomyces bullatus，缝壳菌Lophiostma cre-natum，这些菌可能是潜在的生防菌株，或是在真核生物与寄主柑橘的互作关系中可发挥重要作用的菌株。

2.4.2不同区域不同品种有病症组物种组成差异

将12个有病症组中丰度显著高于无病症组的物种进行进一步分析，结果表明12个有病症组叶样物种组成结构及丰度均存在较大差异（图8）。经方差分析显示3个在有病症组中丰度高的物种uncul-tured Apatococcus、H. luteoviridis、C.gloeospori-oides在2个不同地点的不同品种上的丰度差异极显著（P<0.01）。

2.4.2.1同一地区不同品种间有病症组叶际生物组成差异

在忠县的6个有病症组中，丰度排名前5的物种分别为uncultured Apatococcus、H. luteoviridis、C.sessilis、H. hainangensis、D. mrakii，其中uncul-tured Apatococcus占绝对优势，是其他物种丰度总和的1.3倍;忠县甜橙的有病症组中的优势种为un-cultured Apatococcus，其次为H. luteoviridis和H.hainangensis，其中，忠县‘卡拉卡拉滋生青苔后的叶片上丰度高的物种为H. luteoviridis、uncultured Apatococcus、H. hainangensis、Chloroidium ellip-soideum、C.gloeosporioides、Kalinella bambusico-la、Hausmanniella discoidea;忠县‘塔罗科血橙有病症叶片上丰度高的物种为uncultured Apatococ-cus、D.mrakii、H.luteoviridis、C.sessilis、C.gloeosporioides、O.erternus、H. hainangensis;忠县‘纽荷尔有病症叶片上丰度高的物种为uncultured Apatococcus、H. luteoviridis、H. discoidea、H.hainangensis、C.gloeosporioides;忠县杂柑的优势种除uncultured Apatococcus外，3个品种间的差异较大。忠县‘W·默科特有病症叶片上丰度高的物种为uncultured Apatococcus、C.sessilis、H. hain-angensis、H. luteoviridis;忠县‘沃柑有病症叶片上丰度高的物种为uncultured Apatococcus、C.sessil-is、H. luteoviridis;而忠县‘春见有病症叶片上丰度明显很高的物种仅有uncultured Apatococcus。忠县的6个品种有病症组的叶际生物组成中‘卡拉卡拉与‘纽荷尔、‘W·默科特与‘沃柑有一定相似性，而‘塔罗科血橙‘春见的真核生物组成与其他品种显著不同。

在开州的6个有病症组中，丰度排名前5的物种分别是H. luteoviridis、H. hainangensis、C.el-lipsoideum、Cryptococcus sp. CFL-2008a、uncul-tured Apatococcus，与忠县有病症组叶片的优势种组成差异明显。开州‘卡拉卡拉滋生青苔后的叶片上丰度高的物种为C.ellipsoideum、H. luteoviri-dis、Cryptococcus sp. CFL-2008a，C.sessilis;开州‘塔罗科血橙有病症叶片上丰度高的物种为H.hainangensis、H. luteoviridis、H. discoidea;开州‘纽荷尔有病症叶片上丰度高的物种为H.hainan-gensis、uncultured Apatococcus、H.luteoviridis;开州‘W·默科特有病症叶片上丰度高的物种为Cryptococcus sp. CFL-2008a、H. hainangensis、uncultured A patococcus、H. luteoviridis，开州‘沃柑有病症叶片上丰度高的物种为H. luteoviridis、C.ellipsoideum、H. hainangensis、uncultured Apato-coccus;开州‘春见有病症叶片上丰度较高的物种为H. luteoviridis、C.ellipsoideum;开州‘沃柑和‘春见有青苔病症的叶际真核生物组成较为相似，而其他4个品种的组成差异大。

2.4.2.2同一品种不同地区间有病症组叶际生物组成差异

青苔滋生后，同一品种不同地区的柑橘叶际真核生物结构有很大差异。忠县有病症样本的主要优势种为uncultured Apatococcus（占56. 55%），其次是H. luteoviridis（占13. 64%），开州有病症样本的主要优势种为H. luteoviridis（占32. 42%）和H.hainangensis（占23. 98%）。

忠县‘卡拉卡拉有病症组的主要优势种为H.luteoviridis、uncultured Apatococcus、H. hainan-gensis，而开州‘卡拉卡拉有病症组的主要优势种为C.ellipsoideum、H.luteoviridis、Cryptococcus sp.CFL-2008a，并且K. bambusicola在忠县‘卡拉卡拉有病症组的存在量较高，而在开州‘卡拉卡拉有病症组叶片上没有被检出;忠县‘塔罗科血橙有病症叶片上丰度高的物种为uncultured Apatococcus、D. mrakii、H. luteoviridis，开州‘塔罗科血橙有病症叶片上丰度高的物种为H. hainangensis、H.luteoviridis、H. discoidea，M. magnisporus以较高的丰度存在于忠县‘塔罗科血橙有病症叶际，而在开州‘塔罗科血橙有病症组中不存在;忠县‘纽荷尔有病症叶片上丰度高的物种为uncultured Apa-tococcus、H. luteoviridis、H. discoidea，开州‘纽荷尔有病症叶片上丰度高的物种为H. hainangen-sis、uncultured Apatococcus、H. luteoviridis;忠县‘W·默科特有病症叶片上丰度高的物种为uncul-tured Apatococcus、C.sessilis、H. hainangensis，开州‘W·默科特有病症叶片上丰度高的物种为Cryptococcus sp. CFL-2008a、H. hainangensis、un-cultured Apatococcus，虽然两地的优势种相似，但在丰度上差异巨大;忠县‘沃柑有病症叶片上丰度高的物种为uncultured Apatococcus、C.sessilis、H.luteoviridis，开州‘沃柑有病症叶片上丰度高的物种为H. luteoviridis、C.ellipsoideum、H. hainan-gensis;忠县‘春见有病症叶片上丰度很高的物种仅为uncultured Apatococcus，而开州‘春见有病症叶片上丰度较高的物种为H. luteoviridis和C.ellip-soideum。

3结论与讨论

本研究运用高通量技术对采自重庆忠县和开州6个品种有青苔病症和无病症的24份柑橘叶片样本的真核生物物种进行了检测。结果表明，柑橘叶际真核生物中的优势属是枝孢菌属Cladosporium、橡胶藻属Heveochlorella、杯梗孢属Cyphellopho-ra、Parastagonospora、Knufia等。枝孢菌属、白粉菌属是常见的病原菌，其中枝孢菌属也是拟南芥、小麦等植物中常见的内生真菌。多样性分析显示，24份样品的生物多样性较为丰富，且不同样品间多样性指数存在差异。

传统意义上讲，病原物的确定必须通过柯赫氏法则的验证，但由于一些病害的病原不可纯培养（如柑橘黄龙病）或病害由2种、3种乃至更多种病原物复合侵染造成，这给病原物的验证带来一定阻碍和困扰。利用高通量测序技术可高效准确鉴定出多种生物的类型，也给病原物的确定提供了新的技术途径。多数情况下，有病症组织中病原物的丰度会显著高于未患病的组织，因此本研究推测在有病症组中丰度显著高于无病症组的生物类群为可能的病原。但有研究表明，单纯依靠菌群相对丰度来确认潜在的病原菌不完全准确，有些病原菌的丰度较低，但却对寄主的微生态平衡发挥着重要的作用。本研究结果显示，不可培养的球藻uncultured Apa-tococcus、黄绿异小球藻H. luteoviridis、海南橡胶藻H. hainangensis、无柄杯梗孢C.sessilis、椭圆球藻C.ellipsoideum在有病症组中的丰度极高，很有可能是柑橘青苔的主要病原。有学者研究认为虚幻球藻和胶孢炭疽菌是柑橘青苔的病原，这与本研究的结果有很大的不同，可能是由于病原组成受环境因素和时间变迁的影响发生了演替变化，也可能是研究技术的改进所致。黄绿异小球藻富含类胡萝卜素，可以利用超声破碎等技术从中提取类胡萝卜素和油脂，但有关它是否会引起植物的藻害尚未见报道。橡胶藻属是共球藻纲中一种了解甚少的单细胞绿藻，它是能附生在植物叶表形成青苔的主要分支类群;海南橡胶藻是大王棕树表主要的附生绿藻，并且它可以寄生到棕树体内;海南橡胶藻也是一种含油量高的资源藻类。无柄杯梗孢是一种分布广泛的外寄生菌，它可寄生在香蕉、竹子、苹果等植物体表，造成煤污病。椭圆球藻是一种在陆生环境中普遍存在的绿藻，在大理石材料表面它会富集形成青苔，并且它在驯鹿苔的再生过程中有重要作用。

本试验结果表明12份有病症组叶样中物种组成结构及丰度均存在较大差异，经方差分析显示3个主要优势种在2个不同地点的不同品种上的丰度差异极显著。从地域来看，不同区域优势种的群落结构差异巨大。在北美地区报道了马铃薯品种对疮痂病的易感性在区域与区域、季节与季节之间的差异，而在另一项研究中块茎的易感程度还受植物基因型的微弱影响，也可能受土壤的pH、降水量、温度等自然环境因素的影响。马铃薯疮痂病病斑类型与致病菌的种类、马铃薯品种的感病程度和环境条件有关，马铃薯疮痂病病原链霉菌的种类受种植环境和气候因素影响较大，其分布也存在明显的地域性。由于地域环境、生态条件等的不同或变化，不同地区引发黄芪根腐病的致病菌群组成和优势致病菌存在差异。在本研究中，区域对青苔优势种种类的影响大于品种对优势种群落结构的影响，不同区域间的最主要优势种类群完全不同，且同一区域内不同品种间优势种群落结构仍存在一定差异。地域对病原类群影响大的原因可能是不同区域的气候特征条件下，不同病原的生态适应性不同。品种对病原构成有影响可能是不同品种间的组织结构和生理代谢不尽相同，组织结构和代谢产物等会对病原的侵染、繁殖等產生影响，具体机制有待进一步研究。

本研究分析得到的青苔可能病原藻鲜见有危害柑橘的报道。因此，后续可以从病原藻与寄主间的互作机制以及病原物复合侵染机理等方面开展基础研究。同时，根据不同地域和品种的柑橘滋生青苔会对柑橘叶际真核生物群落结构产生巨大影响的特点，有针对性开展适宜的柑橘青苔防治策略研究，为柑橘青苔的高效绿色综合防控打下基础。