沈雅丽 潘阳阳 王靖雷 马睿 赵改红 王桂荣 张倩 王萌

（甘肃农业大学动物医学院，兰州 730070）

在药物开发早期阶段，筛选药物用于靶标验证和ADMET（吸收absorption，分布distribution，代谢metabolism，消除elimination和毒性toxicity）分析非常重要［1-2］，目前已有筛选方法评估小分子药物药理特性和调控机制，如动物体内试验、高通量LCMS-MS方法等［3］，但由于成本高、试验周期长，这些方法仅提供有限用途。因此寻求一种快速、高效的药物筛选方法已成为近年来的研究焦点之一。孕烷X受体（pregnane X receptor，PXR）是核受体家族的重要成员之一，由NR1I2基因编码，是机体解毒的重要核转录因子。PXR在药物代谢方面和药物相互作用方面具有重要作用，临床上约50%药物通过激活PXR介导的CYP3A4酶进行代谢［4］，并且还发现其参与更多的生理、病理过程，如维持机体细胞增殖分化、生长发育、新陈代谢、稳态维持和多种代谢性疾病、炎症、癌症等［5-6］。目前国内外已报道有关PXR和（或）其配体如何诱导或调节重要生理过程的研究［7-8］。PXR活化后影响药物代谢酶和药物转运蛋白的表达与代谢，如细胞色素酶P450（cytochrome P450，CYP450）、谷胱甘肽转移酶（glutathione-S-transferases，GSTs）、葡糖醛酸基转移酶（UDP-glucuronyl transferases，UGTs）、多药耐药蛋白（multidrug resistance proteins，MDRs）、有机阴离子转运多肽酶（organic anion transport peptidases，OATPs）等［9-10］。因此，寻找PXR的新诱导剂，不仅可以对研究CYPs的诱导及相应药物-药物相互作用和药物研发提供指导，对于疾病的治疗也具有极大意义。报告基因技术在基于细胞检测方法的开发中发挥了重要作用［11］。本实验旨在建立pGL3-basic-PXRpro报告基因药物筛选方法，并考察恩诺沙星、氟苯尼考以及10种连翘天然产物激活mPXR的诱导效应。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物、细胞株与质粒 昆明小白鼠（20± 5 g）购自中国科学院兰州兽医研究所实验动物中心（SCXK（甘）2015-0001）。动物购进适应性饲养3 d开始实验，小鼠饲养条件：温度（24±2）℃、湿度50%±5%、12 h明暗循环全价配合饲料以及纯净水供小鼠自由摄取。动物实验程序与福利均符合实验动物伦理学要求（伦理批准编号：GSAUAEW20200911）。Hepa 1-6小鼠肝癌细胞购自赛百慷生物技术股份有限公司；质粒pGL3-basic、pRL-TK购自Promega公司。

1.1.2 主要试剂及药品 RNA提取试剂盒购自美国Omega公司；ClonExpress®II One Step Cloning Kit非连接酶依赖型单片段快速克隆试剂盒、HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper）反转录试剂盒、DL 2 000 Plus DNA Marker和DL 15 000 DNA Marker购自南京诺唯赞生物科技有限公司；GoTaq Green Master Mix 2×、Dual-Luciferase®Reporter Assay System购自Promega公司；限制性内切酶Xho I、Hind Ⅲ均购自TaKaRa公司；通用型DNA纯化回收试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒、质粒大提试剂盒、感受态大肠杆菌Escherichia coli DH5α均购自天根生化科技有限公司；脂质体Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司；DMEM/F-12培养基和胎牛血清购自Gibco公司；地塞米松、恩诺沙星、氟苯尼考、金丝桃苷、熊果酸、秦皮乙素、柚皮素、甘草次酸和莽草酸购自上海源叶生物科技有限公司；连翘酯苷A、连翘苷、连翘脂素和牛蒡子苷购自南京源植科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 基因组RNA提取 取小鼠新鲜肝组织，按Omega RNA提取试剂盒说明书提取总RNA，用HiScriptII 1st Strand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper）反转录试剂盒说明书将其反转录为cDNA，用作PCR模板，-20℃保存，备用。

1.2.2 目的片段引物设计和合成 根据同源重组引物设计原则和小鼠PXR基因启动子序列（选取转录起始位点上游2 kb），采用同源重组法设计引物，引物序列见表1。上游引物加入Xho I酶切位点（CTCGAG），下游引物加入Hind Ⅲ酶切位点（AAGCTT）；引物由上海生工生物工程有限公司合成，PXR启动子扩增片段长度为2 042 bp。构建流程图如图1所示。

图1 pGL3-basic-PXRpro重组质粒构建流程Fig.1 Construction process of pGL3-basic-PXRpro recombinant plasmid

表1 引物序列表Table 1 List of primer sequence used in PCR

1.2.3 目的片段扩增 以1.2.1中反转录的cDNA作为PCR模板，扩增PXR启动子DNA序列。扩增体系为：GoTaq Green Master Mix 2× 10 μL、模板DNA 1 μL、上下游引物各0.5 μL、RNase-free ddH2O 8 μL。反应参数设置：95℃预变性2 min；95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸125 s，扩增35个循环；72℃最后延伸5 min。取5 μL PCR产物于1%琼脂糖凝胶中，在180 V电压下电泳30 min，254 nm紫外灯下观察结果。

1.2.4 pGL3-basic-PXRpro构建及鉴定 从琼脂糖凝胶中切出需回收的目的条带，电泳条带用通用型DNA纯化回收试剂盒对PCR反应产物进行纯化。纯化后再次进行琼脂糖凝胶电泳确认。将PCR纯化产物与pGL3-basic分别进行双酶切。将双酶切后的DNA片段和线性化pGL3-basic载体用ClonExpress®II One Step Cloning Kit试剂盒进行连接，重组反应体系（20 μL）见表2。体系置于PCR仪中37℃，反应30 min降至4℃，或立即置于冰上冷却。连接的PCR产物转化感受态细胞DH5α，接种于含氨苄抗性的LB培养皿培养12-16 h，挑取重组反应转化板上阳性克隆菌落，用F和R引物进行菌落PCR以鉴定目的片段是否转入。将经过鉴定的阳性克隆菌落提取质粒，送上海生工生物工程有限公司进行测序。构建成功后重组载体命名为pGL3-basic-PXRpro。

表2 重组反应体系Table 2 Recombination reaction system

1.2.5 细胞培养与转染 Hepa 1-6小鼠肝癌细胞培养在Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM/F-12），另加10%胎牛血清、1%青/链霉素、1%丙酮酸钠，培养条件为37℃、5%二氧化碳。设空白组（只铺细胞不做转染）、空载组（0.2 μg pGL3-basic + 0.01 μg pRL-TK）、携带报告基因载体的对照组（0.2 μg pGL3-basic-PXRpro + 0.01 μg pRL-TK）、小鼠PXR的阳性诱导剂地塞米松组（地塞米松 + 0.2 μg pGL3-basic-PXRpro + 0.01 μg pRL-TK）。转染前，将Hepa 1-6细胞以2×104/孔接种于96孔板培养，待生长融合度达70%-80%；在转染前1 h，换无血清DMEM培养基，PXR的阳性诱导剂地塞米松组加入含地塞米松（10 μmol/L）的培养基；转染时，将质粒瞬时转染至相应孔内细胞，实验按Lipofectamine 2000转染试剂盒提供的方案操作。每组设3个复孔，独立重复实验3次。

1.2.6 双荧光素酶活性检测细胞 经转染处理24 h后，用预冷的PBS溶液润洗3次，尽量吸净孔内的液体，按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒的操作说明，用GLOMAX 20/20发光检测仪进行双荧光素酶活性测定。主要操作步骤：用ddH2O将5×Passive lysis buffer 5倍比稀释，以每孔20 μL体积加入到96孔板中，于水平摇床室温轻缓晃动15 min，至细胞裂解完全。取上述各孔细胞裂解液10 μL于1.5 mL EP管中，加50 μL LAR II，快速测定萤火虫荧光素酶活性。再加50 μL Stop＆GLO试剂，测定海肾荧光素酶活性。记录萤火虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性的比值。

1.2.7 恩诺沙星、氟苯尼考以及10种连翘天然产物对PXR启动子的诱导作用 应用pGL3-basic-PXRpro报告基因法检测恩诺沙星、氟苯尼考及连翘中10种天然产物对mPXR的激活作用。采用等差法进行药物稀释，药物浓度为0、20、40、60、80、100 μmol/L。以10 μmol/L的地塞米松作为阳性对照，将0.2 μg pGL3-basic-PXRpro + 0.01 μg pRL-TK共 转染每孔细胞。按照1.2.5中的步骤处理细胞，24 h后根据1.2.6的方法测定双荧光素酶活性。每组设3个复孔，独立重复实验3次。

1.2.8 统计学处理 使用GraphPad Prism软件对各组荧光素酶活性的试验结果进行统计学分析，采用SPSS软件对试验结果进行组间单因素方差分析和t检验，以P＜0.05为差异显著。

2 结果

2.1 小鼠PXR启动子区域扩增

以1.2.1中反转录的cDNA作为模板扩增PXR启动子区域序列，得到长度为2 042 bp的片段，PCR产物凝胶电泳鉴定结果见图2，PXR启动子扩增片段大约为2 000 bp。

图2 PCR扩增PXR启动子片段凝胶电泳Fig.2 Gel electrophoresis of PCR amplified PXR promoterfragment

2.2 重组质粒的筛选及菌落PCR

将PXR启动子片段条带进行纯化回收，将PXR启动子片段和pGL3-basic载体双酶切（Xho I和Hind Ⅲ）后进行重组反应，重组产物转化感受态细胞DH5α，涂布含氨苄抗性的LB培养皿，过夜培养，重组反应转化板上形成数百个单克隆菌落，阴性对照反应转化板上的克隆菌落数显著少于前者，结果如图3所示。在重组反应转化板上挑取阳性克隆菌落进行菌落PCR，结果如图4所示，第2泳道中扩增条带大小约为2 000 bp。说明重组质粒中含有PXR启动子片段。

图3 重组产物转化Fig.3 Recombinant product transformation

图4 菌落PCR凝胶电泳Fig.4 Colony PCR gel electrophoresis

2.3 重组质粒的双酶切及测序鉴定

将初步筛选的阳性单克隆菌落进行摇菌、小提质粒后进行双酶切，结果如图5所示，重组质粒在相应片段大小的位置切出载体片段和目的DNA片段，释放2 042 bp大小的片段。测序结果（图6）可知，由于测序时杂质干扰的原因，两端大约50 bp干扰较大，有1-2 bp突变，其余与原序列完全一致，证实重组质粒包含PXR启动子序列且插入方向正确。以上结果表明包含PXR启动子序列的报告基因载体pGL3-basic-PXRpro构建成功。

图5 pGL3-basic-PXRpro双酶切鉴定电泳Fig.5 Gel electrophoresis of pGL3-basic-PXRpro by double restriction enzymes digestion

图6 pGL3-basic-PXRpro的部分测序结果Fig.6 Partial sequencing results of pGL3-basic-PXRpro

2.4 地塞米松对pGL3-basic-PXRpro报告基因转录活性的验证

用mPXR的经典诱导剂地塞米松（10 μmol/L）来验证pGL3-basic-PXRpro作为药物筛选工具的可行性和有效性。由图7可以看出，携带报告基因载体的对照组（图7-C）相对荧光素酶活性显著高于空载组（图7-B）（P＜0.05），小鼠PXR阳性诱导剂地塞米松组（图7-D）相对荧光素酶活性显著高于携带报告基因载体的对照组（P＜0.05）。由表3可以看出，经过3次独立重复实验结果显示每个样品的相对荧光素酶活性表达稳定，小鼠PXR阳性诱导剂地塞米松组的相对荧光素酶活性之间无显著差异（P＞0.05）。以上结果证明，pGL3-basic-PXRpro作为药物筛选工具的可行性和有效性。

表3 地塞米松3次独立重复实验的相对荧光素酶活性Table 3 Relative luciferase activity of dexamethasone in three independent repeated experiments

图7 PXR启动子报告基因药物筛选方法构建的验证Fig.7 Validation of constructed PXR promoter reporter gene drug screening method

2.5 两种抗菌药对pGL3-basic-PXRpro报告基因转录活性的影响

应用已成功构建的报告基因药物筛选方法检测恩诺沙星、氟苯尼考对mPXR启动子的激活作用。0.2 μg pGL3-basic-PXRpro和0.01 μg pRL-TK 共 转 染 的Hepa 1-6细胞经地塞米松（10 μmol/L）及恩诺沙星、氟苯尼考孵育24 h后，根据1.2.6方法检测相对荧光素酶活性。如图8所示，恩诺沙星、氟苯尼考在20-100 μmol/L对PXR启动子均有激活作用。

图8 两种抗菌药作用Hepa 1-6细胞后的相对荧光素酶活性Fig.8 Relative luciferase activity of two antibacterial drugs after treated in Hepa 1-6 cells

2.6 基于小鼠pGL3-basic-PXRpro报告基因法对10种连翘天然产物的筛选

应用已成功构建的报告基因药物筛选方法检测10种连翘天然产物对mPXR启动子的激活作用。0.2 μg pGL3-basic-PXRpro和0.01 μg pRL-TK 共 转 染 的Hepa 1-6细胞经地塞米松（10 μmol/L）及10种天然产物孵育24 h后，根据1.2.6方法检测相对荧光素酶活性。如图9所示，金丝桃苷在20-100 μmol/L对PXR启动子均有激活作用，20-60 μmol/L对PXR启动子是激活作用，但在80-100 μmol/L激活作用逐渐降低；熊果酸在20-100 μmol/L均可激活PXR启动子；秦皮乙素对PXR启动子的激活作用最弱，在20-100 μmol/L对PXR启动子的激活作用变化不大；柚皮素在20-60 μmol/L对PXR启动子具有激活作用且呈剂量依赖性，但在80-100 μmol/L无PXR启动子活性；甘草次酸在20-60 μmol/L浓度下可以激活PXR启动子无剂量依赖，在80-100 μmol/L则对PXR 启动子无激活作用；莽草酸在20-40 μmol/L对PXR启动子无激活作用，但在60-100 μmol/L对PXR启动子有激活作用；连翘酯苷A在20-100 μmol/L对PXR启动子激活作用最为明显；连翘苷在20-100 μmol/L对PXR启动子均有激活作用，但在100 μmol/L时相对活性降低，20-80 μmol/L呈剂量依赖；连翘脂素在20-100 μmol/L对PXR启动子均为诱导作用并呈剂量依赖；牛蒡子苷对PXR启动子激活作用较高，在20-60 μmol/L呈剂量依赖，80 μmol/L激活作用下降，在100 μmol/L对PXR启动子无激活作用。9种天然产物对PXR启动子转录活性有一定的诱导作用，具有显著统计学差异（P＜0.05）。

图9 10种连翘天然产物作用Hepa 1-6细胞后的相对荧光素酶活性Fig.9 Relative luciferase activity of 10 kinds of Forsythia suspensa natural products treated on Hepa 1-6 cells

3 讨论

我国中草药资源丰富，目前已有较多报道表明中药提取物和天然产物可激活PXR起到治疗疾病的作用［12-13］。阐明PXR在生理或病理过程中的作用既是在药理学的重大挑战，又是确定新的药物发现靶标的潜在机会［14］。因此构建一种基于mPXR启动子双荧光素酶报告基因的药物筛选方法具有重要意义。如何快速、高效的筛选PXR诱导剂，不仅有助于研究PXR诱导的CYPs药物-药物相互作用，还可以为药物研发和临床用药安全提供一定的理论指导。

地塞米松是小鼠PXR公认的经典诱导剂［15］，通过地塞米松来验证pGL3-basic-PXRpro报告基因药物筛选方法/模型的可行性和有效性。本试验结果显示，携带报告基因载体的对照组较空载组差异显著，表明构建的小鼠pGL3-basic-PXRpro报告基因具有启动子活性，其相对活性为0.112 9；小鼠PXR阳性诱导剂地塞米松组较携带报告基因载体的对照组差异显著，说明地塞米松能显著诱导PXR的转录活性。以上结果证明基于小鼠pGL3-basic-PXRpro报告基因的药物筛选方法构建成功，作为药物筛选工具是可行的。由表3可以看出，经过3次独立重复实验结果显示每个样品的相对荧光素酶活性表达稳定，小鼠PXR阳性诱导剂地塞米松组的相对荧光素酶活性之间无显著差异。进一步证实了pGL3-basic-PXRpro作为药物筛选工具的有效性。总之，pGL3-basic-PXRpro报告基因药物筛选方法可用于筛选诱导PXR的药物单体及天然产物。

抗菌药物可刺激肝脏解毒的I相酶［16］，也可诱发药物性肝损伤［17］，PXR是肝脏药物清除系统的主要调节因子，在药物性肝损伤起关键作用［18］。恩诺沙星和氟苯尼考是新一代常见的动物专用抗菌药，均能通过影响肝脏CYP450酶对肝脏造成损伤［19-21］。将构建成功的报告基因药物筛选方法用于考察恩诺沙星和氟苯尼考对PXR启动子的诱导效应。刘婉玉等［22］通过代谢抑制实验得出，恩诺沙星在鲫鱼肝微粒体代谢过程中的关键酶是CYP3A4。本试验结果表明，20-100 μmol/L恩诺沙星能显著诱导PXR的表达。由此推断恩诺沙星可能是通过PXR介导的CYP3A4酶进行代谢。有研究表明，氟苯尼考对家兔肝脏CYP3A的基因表达具有诱导作用，但家兔肝脏中CYP3A的诱导是否由PXR介导有待进一步研究［23］。本试验结果表明，20-100 μmol/L氟苯尼考能显著诱导PXR的表达，但氟苯尼考是否通过诱导PXR介导的CYP3A酶进行代谢，有待进一步研究。由于种属之间存在差异，恩诺沙星、氟苯尼考对PXR靶基因的作用还需进一步研究。

近几年连翘用量逐年增长，作为常用大宗药材之一，连翘具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗癌、保肝等药理作用，具有很好的开发前景和药用价值［24］。本试验采用报告基因药物筛选法对连翘的10种天然产物进行了筛选。有研究表明配体激活的PXR通过抑制核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）和激活蛋白1（activator protein-1，AP-1）在肝脏中的表达而发挥抗炎作用［25-26］。本试验结果表明100 μmol/L连翘脂苷A、20-80 μmol/L金丝桃苷和20-60 μmol/L牛蒡子苷均能显著诱导PXR的表达，与陈丽青［27］、Pan等［28］、Kim等［29］、Lee等［30］的研究结果一致，表明通过pGL3-basic-PXRpro报告基因药物筛选方法筛选的3种天然产物对PXR具有诱导作用，提示3种天然产物可能具有作为PXR介导抗炎候选药物的潜力，对临床用药具有参考价值。PXR的激活使肝脏中药物代谢速率加快并诱导多药耐药蛋白（MDR）表达，大多数药物抗性酶的产生由PXR靶基因编码，因此在癌症化疗过程中更易发生多药耐药［31］。有研究发现连翘提取物具有逆转多药耐药作用［32-34］，本试验结果表明熊果酸、柚皮素、莽草酸、牛蒡子苷等均对PXR有诱导作用，进一步研究连翘提取物与PXR之间的关联，可为治疗癌症药物的研究开发提供新方向。另外，有研究报道，熊果酸能够通过激活PXR的表达抵抗四氯化碳导致的急性肝损伤和肝脏纤维化损伤［35-36］。本试验结果表明，20-100 μmol/L熊果酸能显著诱导PXR的表达，提示熊果酸可能具有作为PXR介导抗急性肝损伤、抗肝脏纤维化损伤候选药物的潜力。樊威洋等发现，100 μmol/L柚皮素能显著下调HepaRG细胞PXR的蛋白表达，柚皮素可以发挥抗肝癌和肝损伤的作用［37-38］，为肝病治疗提供理论依据。本试验结果显示，20-60 μmol/L柚皮素对PXR起激活作用，80-100 μmol/L起抑制作用，提示柚皮素发挥抗癌和抗肝损伤作用的最佳用量可能在80-100 μmol/L之间。He等［39］研究发现，柴胡疏肝散中的生物活性成分甘草次酸有提高细胞核受体PXR蛋白表达量的趋势，但没有显著差异，甘草次酸可激活PXR来增强CYP3A4的表达，从而起到治疗抑郁症的作用。本试验结果表明，20-60 μmol/L甘草次酸能显著诱导PXR的表达，说明了甘草次酸可激活PXR，但没有显著差异，He等同样佐证了本试验中甘草次酸对PXR的诱导作用。Rasmussen等［40］在研究菊苣次生代谢物对原代猪肝细胞CYP mRNA表达的调节时发现，菊苣次生代谢物秦皮乙素对CYP3A没有诱导作用，而对CYP1A2具有诱导作用，秦皮乙素可能是激活了AhR。由于种属之间存在差异，秦皮乙素对CYPs的作用有待进一步研究。本试验结果表明，不同浓度秦皮乙素对PXR启动子的激活作用变化无显著差异，提示秦皮乙素可能不是PXR配体。

综上所述，采用本试验构建的pGL3-basic-PXRpro报告基因药物筛选方法可以快速、便捷地筛选出PXR的诱导剂。本试验研究结果说明了恩诺沙星、氟苯尼考以及10种连翘天然药物对PXR转录水平的干预，报告基因药物筛选方法为有效筛选PXR介导的肝损伤和药物研发提供工具，同时为PXR为靶点的疾病防治提供候选药物。报告基因药物筛选方法作为体外PXR诱导剂的初筛手段，体内的作用机制还需进一步探究。

4 结论

本研究成功构建了小鼠pGL3-basic-PXRpro报告基因载体，建立了pGL3-basic-PXRpro报告基因的药物筛选方法，并成功筛选出了PXR的诱导剂。报告基因药物筛选法具有快速高效且操作周期短的特点，为进一步研究PXR介导的肝损伤机制和药物研发奠定了基础。