亓照耀， 杨 帆， 吕孟可， 杨丽萍， 袁海燕， 闫民泽， 张慧娜

(河南中医药大学，郑州 450046)

中医自古就对恐、肾、骨三者的关系有深刻认识。在《黄帝内经》中就已提出“肾主骨”理论，其中《素问·阴阳应象大论篇》曰：“肾生骨髓……其志为恐，恐伤肾”。恐能伤肾，影响肾先天之精气[1]。《灵枢·本神》又载：“恐惧而不解则伤精，精伤则骨酸痿厥，精时自下。[2]”现代研究提示，恐惧应激可激活孕鼠下丘脑-垂体-肾上腺皮质(HPA)轴，继而影响孕鼠健康，表现出糖皮质激素(GC)水平升高[3]。恐伤孕鼠会造成其幼年仔鼠情志改变，对仔鼠的一般发育及神经发育造成不良影响[4，5]。但母代孕期恐惧应激导致的“肾精亏虚”是否影响子代骨的早期发育鲜见报道。

本研究从“恐伤肾，肾主骨”角度探讨孕期恐伤刺激对56日龄仔鼠股骨发育和血清骨代谢指标I型胶原羧基端交联肽(CTX-I)、骨源性碱性磷酸酶(BALP)和I型前胶原氨基端原肽(PINP)的改变，探索恐伤孕鼠对子代骨发育的影响，论证“恐伤肾虚致胎损”的中医经典理论，揭示“胎损”在骨发育方面的表现及机制。本研究已通过河南中医药大学动物伦理委员会审查，伦理许可证号DWLL2018030017。

1 材料与方法

1.1 动物

7周龄Wistar大鼠40只，雌鼠25只，雄鼠15只，其中雄性270～320 g，雌性180～220 g，由北京维通利华实验动物公司提供许可证号SCXK(京)2016-0006。实验在河南中医药大学实验动物中心进行，饲养环境为温度20 ℃±5℃、湿度40%±15%和12 h明暗循环。适应性喂养1周后，首先采用旷场实验进行行为基线测试，选取基线水平一致且体格较强壮的雄鼠和雌鼠在晚20∶00进行合笼，第2天8∶00检查是否有阴栓，若有则为受孕0.5 d，反之继续合笼。将成功受孕的雌鼠20只按随机数字表法分为对照组和模型组，所有雄鼠作为电击鼠用于建立模型，所有仔鼠延续孕鼠分组饲养至56日龄。

1.2 主要试剂及仪器

CTX-I Elisa试剂盒(伊莱瑞特，E-EL-R1456c)；BALP Elisa试剂盒(伊莱瑞特，E-EL-R0113c)；PINP Elisa试剂盒(伊莱瑞特，E-EL-R1414c)；GC Elisa试剂盒(博士德，KE00022)；微型高速离心机(美国Labnet，C2500-R-230V)；电热恒温培养箱(日本ASONE，ICV-450)；酶标仪(Molecular Devices，Flexstation 3)；热电ICP电感耦合等离子发射光谱仪(美国ARL，ICAP6300)；动物行为学分析软件(ANY-maze)(美国Stoeling, Edition 1.0，上海软隆科技有限公司)；大鼠行为学检测设备(江苏赛昂斯生物技术有限公司提供)。

1.3 建模方法

模型组运用旁观电击法建立妊娠期恐伤大鼠模型[5-7]，用于建立模型的交流电击箱。交流电击箱由透明有机玻璃组成，分为15 cm×15 cm×30 cm的9个小室，中间列3个小室为电击室，两侧列6个小室为旁观室。小室之间有机玻璃板上有若干直径为1 cm小孔，在旁观室靠近电击室侧有供攀爬逃离电击的细铁丝(电击室无铁丝)。旁观孕鼠为逃避电击攀爬在铁丝上，通过听、视、嗅等捕捉临近被电击鼠的恐惧信息，由此给孕鼠产生单纯的恐惧心理刺激。建立模型具体操作如下：将电击雄鼠、旁观模型组孕鼠分别放入电击箱相应的小室内，每2 min鸣响警报声60 s，鸣响时段均匀给予瞬时20 mA电刺激10次，重复操作15次，每次总时30 min，每日2次，持续20 d。

1.4 指标检测

1.4.1 旷场实验 利用动物行为学分析软件(ANY-maze)进行旷场实验。对2组孕7 d、14 d和20 d的孕鼠及按随机数表选取的56日龄仔鼠进行心理应激评价，测试时间为5 min。黑色旷场测试箱(100 cm×100 cm×45 cm)底面被分为25个正方形小格(20 cm×20 cm)。安静环境下，抓住大鼠尾根尖1/3处提起，轻轻放入测试箱正中格，适应1 min后，记录5 min内大鼠穿格次数(双后肢穿过一格记1分)、直立次数(双前肢离地直立一次记1分)、修饰次数和尿便次数。

1.4.2 血清生化指标和脏器指标检测 模型组孕鼠在孕20 d时行尾静脉取血，模型组56日龄仔鼠在行为学检测实验结束后，适度麻醉经腹主动脉取血，静置30 min后3000r/min离心15 min取血清。冰面上快速剥离双后肢股骨，在液氮速冻后存置于-80 ℃冰箱保存，所有实验大鼠取材后采用断头法处死。采用ELISA法测定血清生化指标GC、CTX-I、BALP、PINP水平，按试剂盒推荐步骤操作。肾脏脏器系数的具体计算公式为：肾脏脏器系数=肾脏质量/体质量×100，即肾脏质量在每100 g体质量占比。

1.4.3 血清和骨钙磷水平检测 取股骨头样品进行磨细、过筛(0.25 mm筛)、称量0.2 g装入100 mL消煮管底部，加入硝酸5 mL、高氯酸2 mL，200 ℃消煮1 h至澄清，定容至50 mL待测。取血清样品0.5～1.0 mL按上述方法处理制备待测液。采用ICP电感耦合等离子发射光谱仪检测钙磷水平。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 模型评价

表2示，与对照组比较，模型组孕鼠在孕7 d、孕14 d和孕20 d的旷场实验水平得分、垂直得分均降低(P<0.05)。建模结束后，孕20 d GC水平显著升高(P<0.05)。

表1 2组孕鼠孕7 d和14 d旷场实验评分比较(分，

表2 2组孕鼠孕20天旷场实验评分和GC水平比较(分，

2.2 仔鼠行为学与发育评价

表4示，模型组56日龄仔鼠旷场实验水平得分、垂直得分均低于对照组(P<0.05)(表3)，体质量减轻，肾脏质量和脏器系数均降低(P<0.05)。

表3 2组仔鼠旷场实验评分水平比较

表4 2组仔鼠体质量和肾脏发育情况比较

2.3 仔鼠股骨和骨钙磷情况

表5示，与对照组比较，模型组56日龄仔鼠双后肢股骨干重降低(P<0.05)，钙磷含量也均降低(P<0.05)。

表5 2组仔鼠股骨发育和钙磷水平比较

2.4 仔鼠血清钙磷和骨代谢指标水平

表6示，与对照组比较，模型组56日龄仔鼠血清中钙含量降低(P<0.05)，CTX-I的水平显著升高(P<0.05)，BALP和PINP的水平均降低(P<0.05)。

表6 2组仔鼠血清钙磷和骨代谢指标CTX-I、BALP、PINP水平比较

3 讨论

近年来，情志因素对健康的影响受到越来越多的关注。“恐伤肾”是中医七情内伤的经典论述之一。《素问·阴阳应象大论篇》记载：“在脏为肾……在志为恐”，指出“恐”的情志活动与“肾”关系密切[1]。《黄帝内经》也有“肾藏精”“肾主骨”“骨者髓之府”“肾生骨髓”等理论，认为肾与骨的生长发育密切相关[8]。肾在体合骨生髓，又称“肾主骨”，骨的生长有赖于骨髓所养，若肾精不足，骨髓生化无源，则骨失所养，这些都表明“恐”与“骨发育”之间的关系密切。

本研究使用改进的旁观电击法建立孕期恐惧应激大鼠模型。建立模型时，旁观鼠在恐惧心理状态下攀爬箱体躲避电击的同时，又可通过视、听、嗅觉获得恐惧信号，加强应激效果且避免大鼠遭受实质性伤害，其模型的重现性高，适合建立单纯慢性恐惧心理应激模型[3]。慢性恐惧应激可致HPA轴过度激活,使血清中GC含量升高，可作为评价慢性应激程度的可靠指标。研究表明，恐伤孕鼠的HPA轴激活，促肾上腺皮质激素和GC水平均升高[3，4]。本研究结果表明，与空白组比较，模型组孕鼠行为学评价异常，GC水平升高，提示恐伤孕鼠模型建立成功。

肾主藏精，主生长发育。既往研究表明，恐伤孕鼠不仅对子代仔鼠的发育[3,9]、情志及空间学习等能力具有调控作用[7,10]，而且影响脑部神经递质水平[5]。本研究发现，模型组56日龄仔鼠出现了体质量减轻和行为学异常，提示恐惧应激影响了子代发育和情志。从中医理论来讲，母孕期受恐，伤及其肾，致使肾精不足，“先天有亏，子气应之”，子所蕴先天之精气不足影响其生长发育。本研究发现，仔鼠的肾脏质量和股骨干重减轻，脏器系数降低，提示母鼠孕期恐伤肾导致的肾精亏虚影响子代的正常生长和股骨的发育。

骨骼是代谢活跃的组织，PINP和CTX-I是敏感的骨形成及骨吸收指标[11，12]。钙、磷是骨矿物质中最基本的元素，在骨基质钙化过程中具有重要作用，其减少影响骨骼的发育[13]。正常情况下机体通过血钙与骨钙的交换来维持血钙相对稳定，当血钙浓度升高时钙可向骨沉积，当血钙浓度降低时骨钙会转移到血液中导致骨钙流失，可能引起骨代谢紊乱[14，15]。本研究发现，模型组仔鼠血清钙含量降低，骨中钙磷含量也出现降低，提示模型组仔鼠的股骨质量减轻的原因可能与骨钙磷减少有关。

骨转换是成骨细胞和破骨细胞等紧密合作的骨骼代谢动态过程[16，17]。骨代谢生化指标是骨组织分解与合成的中间产物，相比骨密度检测更灵敏。骨转换生化指标比较敏感，是评价骨早期发育的重要方法[18，19]。骨基质蛋白90%以上是Ⅰ型胶原，PINP是骨形成中Ⅰ型原胶原代谢成胶原的中间产物，可敏感而特异性地反映成骨细胞活性，在应用中有重要意义[20]。CTX-I是骨吸收过程中Ⅰ型胶原降解产物，可特异性地反映破骨细胞活性[21，22]。BALP由成骨细胞分泌，可以促进骨基质钙化。旧骨被吸收，钙磷释放至血液，在新骨重建时BALP促进血中钙磷重新沉着于新建的骨组织。本研究发现，模型组仔鼠血清CTX-I升高，PINP和BALP出现降低，表明模型组仔鼠的骨吸收速度高于骨生成速度，这提示骨代谢平衡出现异常，骨流失增强。而且骨钙化速度也减慢，可能是为了进一步弥补血钙流失。模型组仔鼠的骨吸收增快，可能也是股骨质量降低的主要原因，进而影响了骨发育进程。恐惧刺激可能是通过影响肾脏发育进而引起骨发育和代谢的紊乱，但其具体作用机制仍待进一步探索。

综上所述，恐伤孕鼠的子代不仅情志认知改变，而且骨代谢也出现紊乱，肾精亏虚是造成这种紊乱的原因之一。这为“肾主骨”“恐伤肾”的中医经典理论提供了客观实验依据，也为中药防治肾经亏虚导致的骨发育异常提供参考。