车 洋，贺天锋，陈 同，林 律

作为全球公共卫生热点问题的耐多药结核病(multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB)的流行和传播给国内结核病的防控工作持续带来严峻挑战。流动人口因其流动性强、患病后治疗管理困难、经济条件差等原因一直被认为与结核病的耐药高度相关[1-2]。宁波地处沿海经济活跃地区，商贸活动频繁，流动人口占比较大。因此，深入探究本地区流动人口结核病耐药状况对合理制定结核病防控策略具有重要意义。

二线注射类药物卡那霉素(KAN)、阿米卡星(AMK)、卷曲霉素(CAP)和氟喹诺酮类药物氧氟沙星(OFX)、左氧氟沙星(LVX)是MDR-TB治疗的核心药物[3-4]，但随着这些二线抗结核药物的广泛使用，针对这些药物的耐药问题也逐年严峻。为深入探讨本地区流动人口耐多药肺结核患者二线抗结核药物的耐药状况，本研究对2017-2019年耐药监测期间收集的133例MDR-TB患者资料进行了分组(流动人口组56例，户籍人口组77例)，并对所有MDR-TB患者临床分离菌株的二线抗结核药物耐药相关基因rrs、tlyA、eis、gidB、gyrA、gyrB进行了检测分析。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株来源 研究纳入的133株MDR-TB临床分离株收集自2017—2019年宁波地区9个县(市、区)耐药监测期间筛选的痰培养阳性菌株，均经过菌种鉴定及异烟肼、利福平、链霉素及乙胺丁醇4种一线抗结核药物耐药检测。结核分枝杆菌H37RV标准株来源于中国疾病预防控制中心。耐药相关定义[5]：耐多药(MDR-TB)为至少同时耐异烟肼和利福平的菌株；准广泛耐药(quasi-extensive drug resistance, pre-XDR)为耐多药基础上对1种氟喹诺酮类或1种二线注射类抗结核药物耐药；广泛耐药(XDR-TB)为耐多药基础上至少同时对1种氟喹诺酮类和1种二线注射类抗结核药物耐药。

1.1.2 试剂来源 分离培养、菌种鉴定及药敏试验培养基均购自珠海贝索生物技术有限公司。结核分枝杆菌DNA提取、PCR扩增等相关试剂及技术服务购自上海桑尼生物科技有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 菌株的分离培养、菌种鉴定 按照《结核病诊断实验室检验规程》[6]进行。

1.2.2 药物耐药性实验 异烟肼(isoniazide，INH)、利福平(rifampicin，RFP)、卡那霉素(kanamycin，KAN)阿米卡星(amikacin，AMK)、卷曲霉素(capreomycin，CAP)、氧氟沙星(ofloxacin，OFX)及左氧氟沙星(levofloxacin，LVX)的耐药检测采用WHO/IUATLD 《耐药监测指南》推荐的1%比例法[7]，含药培养基中药物终浓度分别为INH 0.2 μg/mL、RFP 40 μg/mL、KAN 30 μg/mL、AMK 30 μg/mL、CAP 40 μg/mL、OFX 2.0 μg/mL、LVX 2.0 μg/mL。耐药百分比=(含药培养基上生长的菌落数/对照培养基上生长的菌落数)×100%，以耐药百分比大于1%定义为耐药。每批次药敏检测采用结核分枝杆菌H37RV标准株作为质控。

1.2.3 结核分枝杆菌总DNA制备 取一接种环L-J培养基上生长状态良好菌落溶于400 μL TE(pH 8.0)中，震荡混匀后沸水浴15 min，12 000 g/min离心3 min取上清，置—20 ℃保存备用。

1.2.4 耐药基因PCR扩增 6个二线抗结核药物耐药相关基因引物序列如表1所示，PCR反应体系总体积20 μL：2×Taq PCR MasterMix 10 μL(TIANGEN)，DNA模板1 μL(50 ng)，Forward Primer (20 mmol/L) 1 μL，Reverse Primer (20 mmol/L) 1 μL，无菌双蒸水7 μL。反应条件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，58.5 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，30次循环，72 ℃ 3 min。

表1 耐药基因引物序列及其扩增片段Tab.1 Primer sequences for genes with drug resistance

1.6 序列分析 PCR产物送上海桑尼生物科技有限公司测序，使用MegAlign软件对基因测序结果进行分析。参比序列为结核分枝杆菌H37RV标准株DNA序列(GenBank序列号：NC-000962)。

1.2.5 统计学分析 采用SPSS 21.0统计软件进行统计分析，两样本率比较采用χ2检验，检验水准α=0.05。

2 结 果

表2 流动人口耐多药肺结核二线抗结核药物耐药特征Tab.2 Characteristics of second-line anti-tuberculosis drug resistance among migratory patients with MDR-TB

表2(续)特征菌株数量及构成比[n(%)](n=133)流动人口耐多药菌株数量及构成比[n(%)](n=56)户籍人口耐多药菌株数量及构成比[n(%)](n=77)χ2值P值左氧氟沙星 是39(29.32)19(33.93)20(25.97)0.9900.320 否94(70.68)37(66.07)57(74.03)准广泛耐药 是38(28.57)19(33.93)19(24.68)1.3600.243 否95(71.43)37(66.07)58(75.32)广泛耐药 是 8(6.01) 2(3.57) 6(7.79)0.4110.521 否125(93.99)54(96.43)71(92.21)耐药基因突变 rrs基因 是 9(6.77) 5(8.93) 4(5.19)0.2470.619 否124(93.23)51(91.07)73(94.81) tlyA基因 是10(7.52) 1(1.79) 9(11.69)3.2590.071 否123(92.48)55(98.21)68(88.31) eis基因 是 2(1.50) 2(3.57) 0(0.00)0.9010.342 否131(98.50)54(96.43)77(100.00) gidB基因 是 5(3.76) 3(5.36) 2(2.60)0.1330.716 否128(96.24)53(94.64)75(97.40) gyrA基因 是46(34.59)22(39.29)24(31.17)0.9440.331 否87(65.41)34(60.71)53(68.83) gyrB基因 是 4(3.01) 2(3.57) 2(2.60)0.0001.000 否129(96.99)54(96.43)75(97.40)

表3 133株耐多药菌株二线抗结核药物耐药相关基因突变特征Tab.3 Characteristics of gene mutations with second-line anti-tuberculosis drug resistance among 133 MDR-TB isolates from migratory patients

表3(续)耐药基因二线抗结核药物KANAMKCAPOFXLVX核苷酸突变类型氨基酸突变类型流动人口MDR-TB菌株数量(n=56)户籍人口MDR-TB菌株数量(n=77)MDR-TB菌株总数tlyARRRRRT708GAAT-AAG,Leu236Phe011SSSSST708GAAT-AAG,Leu236Phe066SSSRST708GAAT-AAG,Leu236Phe011SSSRRT708GAAT-AAG,Leu236Phe112eisSSSSSA10TACC-TCC,Thr4Arg101SSSRRA10GACC-GCC,Thr4Arg101gidBSSSSS115位缺失C移码突变224SSSSSA208CAGC-CGC,Ser70Arg101gyrASSSRRC269TGCG-GTG,Ala90His448SSSSSC269TGCG-GTG,Ala90His202RSSRRT271CTCG-CCG,Ser91Pro022SSSRRG280AGAC-AAC,Asp94Asn011SSSRRA281CGAC-GCC,Asp94Ala112SSSSRA281CGAC-GCC,Asp94Ala202SSSRRA281GGAC-GGC,Asp94Gly10616SSSRSA281GGAC-GGC,Asp94Gly033SSSSRA281GGAC-GGC,Asp94Gly101RRSRRA281GGAC-GGC,Asp94Gly213SSSSSA281GGAC-GGC,Asp94Gly066gyrBSSSRRT1505GGTT-GGT,Val502Gly112SSSSSG1485TCGG-CGT,Arg495Ala101SSSRSA1495GAAC-GAC,Asn499Asp011

3 讨 论

肺结核疫情是全球面临的热点公共卫生问题，耐药结核病尤其是MDR-TB疫情的出现使得全球结核病防控形势变得更加严峻。国内流动人口原籍地多为结核病疫情高发地区，因其具有流动性强，治疗依从性差，管理困难等特点，流动人口一直被认为是耐药结核病疫情需要防控的重点人群[8]。二线抗结核药物卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素、氧氟沙星和左氧氟沙星是治疗MDR-TB的重要药物，由于这些药物的广泛使用，耐二线抗结核药物的耐多药菌株产生及传播，给本就严峻的MDR-TB疫情防控形势带来了更为严重的挑战。

二线抗结核药物注射剂卡那霉素、阿米卡星和卷曲霉素现今被临床广泛用于MDR-TB的治疗，对这些药物耐药特征的研究可以为临床MDR-TB治愈率的提高和减少广泛耐药结核病(XDR-TB)的产生提供重要的科学依据[9-10]。本项研究显示，流动人口MDR-TB患者临床分离菌株二线抗结核药物注射剂耐药率均较低，与相关研究相符[11-12]，与户籍人口患者临床分离菌株比较差异无统计学意义。这可能与部分二线抗结核注射剂副反应较大，本地区临床使用较少有关。

编码16S rRNA的rrs基因突变与卡那霉素与阿米卡星耐药有关[13-14]，本次研究结果显示，56例流动人口MDR-TB患者临床分离菌株rrs基因突变率与户籍人口患者临床分离菌株比较差异无统计学意义，流动人口MDR-TB患者临床分离菌株rrs基因点突变位点在1 401位和514位，突变类型为A1401G和A514C，与研究报道符合[15-16]。tlyA基因的开放阅读框(ORF)内包含一个具有甲基转移酶活性的功能基团，在结核分枝杆菌rRNA甲基化过程中起到促进rRNA成熟，促进药物转运的作用[17]。有研究显示，该基因发生断裂、缺失或突变，则细菌会对药物产生耐药性，且结核分枝杆菌该基因突变主要为点突变[18]。本次研究结果显示，10株tlyA基因发生突变的菌株中(流动人口1株，户籍人口9株)，二线注射剂耐药的仅1株(户籍人口)，而其余9株均为二线注射剂敏感，提示tlyA基因突变与二线注射剂的耐药性关系无特异性。结核分枝杆菌增强胞内存活基因(enhanced invracellular survival, eis)及其编码蛋白EIS(乙酰转移酶家族成员)可增强结核分枝杆菌在巨噬细胞内的存活能力，有研究显示，eis基因启动子区域突变与二线注射剂类药物低水平耐药有关[19]。本次研究结果数据显示，133株MDR-TB患者临床分离菌株中eis基因突变仅2株(均为流动人口)，且均为二线注射剂敏感菌株，提示eis基因启动子区域突变与二线注射剂类药物耐药之间关系尚不明确。广泛存在于细菌基因组中的gidB基因编码一种rRNA甲基转移酶，其靶点16S rRNA的G527正常甲基化对于氨基糖苷类药物与16S rRNA的稳定结合起到至关重要的作用[20]。Okamoto等研究发现gidB基因突变会导致16S rRNA的530环不能得到修饰而引起卡那霉素、阿米卡星等氨基糖苷类药物耐药，且gidB基因突变类型较为多样，存在点突变、缺失、插入等[21-22]。本项研究发现，56例流动人口MDR-TB患者临床分离菌株存在gidB基因缺失和点突变情况，突变类型为115位缺失C碱基及出现A208C的点突变。但发生gidB基因缺失和点突变的5株MDR-TB均为二线注射剂敏感，因此，gidB基因突变与二线注射剂类药物的耐药关系值得商榷。

作为耐多药结核病治疗方案中核心药物的氧氟沙星和左氧氟沙星同属于喹诺酮类药物，近年来随着我国广泛使用喹诺酮类治疗社区获得性肺炎等肺部感染性疾病(经济发达地区尤为常见)，造成耐喹诺酮类药物的菌株传播及流行[23]。本次研究结果显示，流动人口MDR-TB患者临床分离菌株喹诺酮类耐药形势依然较为严峻，但与户籍人口患者临床分离菌株比较差异无统计学意义。这一现象提示，喹诺酮类药物在本地区MDR-TB治疗方面存在药品管控、临床经验用药等不足之处，且流动人口MDR-TB人群并不是喹诺酮类耐药的高危人群。结核分枝杆菌喹诺酮类药物的作用靶位是DNA促旋酶，该酶由2个A亚基和2个B亚基构成的四聚体[24-25]。喹诺酮类耐药的分子机制主要是编码DNA促旋酶的gyr基因发生突变(gyrA和gyrB，以gyrA突变为主)，且gyr基因突变频率在不同菌株间差异较大[26-27]。本研究结果显示流动人口MDR-TB 患者临床分离菌株gyrA和gyrB基因突变率与户籍人口患者临床分离菌株比较差异无统计学意义。133株MDR-TB患者临床分离菌株中gyrA突变类型有5种(C269T、T271C、G280A、A281C和A281G)，其中流动人口MDR-TB 患者临床分离菌株gyrA突变类型只有C269T、T271C和A281G 这3种。133株MDR-TB患者临床分离菌株中gyrB突变类型有3种(T1505G、G1485T和A1495G)，其中流动人口MDR-TB患者临床分离菌株 gyrB突变类型为T1505G和G1485T 2种。研究结果显示，与二线注射剂耐药相关基因相比，喹诺酮耐药相关基因gyr基因突变类型种类最多(8种)。

总之，宁波地区流动人口MDR-TB患者临床分离菌株虽然对二线抗结核药物耐药形势较为严峻，但可能该人群不是本地区MDR-TB二线抗结核药物耐药防控的重点人群，今后在进一步加强流动人口MDR-TB患者的治疗管理工作的同时，需对全体MDR-TB病例进行系统性监测和分析，掌握总体流行趋势。