吴巨龙，吕 健，寇增强，宋绍霞，孙 林，何玉洁，刘 倜

流行性感冒是人类最常见的上呼吸道感染性疾病之一，由流感病毒引起。流感病毒根据其核蛋白和膜蛋白的抗原特性不同可以分为甲、乙、丙3型流感病毒。目前，甲型流感病毒根据其表面的血凝素(HA)抗原的不同可分为18个亚型，根据神经氨酸酶(NA)抗原的不同可以分为11个亚型[1]。H3N2流感病毒于1968年开始在人类中传播以来，一直是季节性流感流行的1个主要亚型，季节性H3N2流感具有潜伏期短且传播速度快的流行特点，并且主要在人际间传播，全年各个季节都会发生感染病例，且每隔3～8年便会出现新的抗原漂变株[2]。血凝素(HA)作为流感病毒的重要抗原，可以与细胞表面病毒特异性受体结合并且刺激机体产生中和抗体[3]。病毒的抗原位点和受体结合位点均位于HA上[4]，因此对HA的变异研究尤为重要。本研究拟通过对2019—2020年流感监测年度山东省分离株流感病毒进行抗原性及HA基因特性分析，了解该亚型毒株的变异趋势，为流感的预防和控制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 毒株收集 依据国家流感中心规定，每年4月1日所在周至次年4月1日所在周前一周为一个流感监测年度，因此2019—2020年流感监测年度的采样日期为2019年4月1日至2020年3月29日。采集此期间山东省各国家级哨点医院流感样病例标本，采用犬肾细胞(MDCK)进行流感病毒分离。所有毒株均经过山东省疾控中心复核鉴定后用于本研究分析。我们将此期间收检的甲型H3N2流感病毒根据病毒的采样日期和分离地点随机选取40株病毒用于抗原性分析，并对其中19株病毒进行测序。

1.2 流感病毒的抗原分析 标准参考抗原为WHO推荐的2019—2020年北半球疫苗株A/Kansas/14/2017，其免疫雪貂后的抗血清作为标准参考血清。标准参考抗原及标准参考血清均由中国疾控中心提供。利用红细胞凝集抑制实验(Hemagglutination inhibition, HI)进行抗原性分析，红细胞采用人“O”型血离心洗涤制备，具体方法按照《全国流感监测技术指南》(2017版)。

1.3 序列测定 RT-PCR扩增核酸提取使用西安天隆科技有限公司生产的核酸提取试剂盒(Lot 20042110T025)；基因扩增使用Invitrogen公司的One Step RT-PCR Kit试剂盒，扩增引物序列来自国家流感中心，引物合成由上海Invitrogen完成。扩增产物送上海伯杰生物有限公司进行双向测定。

1.4 序列分析 序列拼接使用Velvet、Bowtie2和Sam tools软件。序列比对使用MEGA.6软件的Clustal W方法，采用Neighbor-Joining方法构建种系进化树。通过NetNGlyc 1.0 Server糖基化位点预测网站对潜在糖基化位点进行在线预测分析。本研究从全球共享流感数据倡议组织GISAID网站下载WHO2014年以来推荐的甲型H3N2亚型流感北半球疫苗株HA序列作为进化树构建骨架，包括A/Texas/50/2012(2014—2015年疫苗株)、A/Switzerland/9715293/2013(2015—2016年疫苗株)、A/Hong Kong/4801/2014(2016—2018年疫苗株)、A/Singapore/INFIMH-16-0019/2016(2018—2019年疫苗株)、A/Kansas/14/2017(2019—2020年疫苗株)、A/Hong Kong/2671/2019(2020—2021年疫苗株)。

2 结 果

2.1 抗原性分析 本次实验参考抗原A/Kansas/14/2017与参考血清自身HI效价为1∶160。所选的40株H3N2毒株与参考血清的HI效价为1∶20的有26株，其余14株中有9株HI效价为1∶40，5株HI效价为1∶80。根据WHO判断标准，当待检病毒与参考血清的HI效价低于参考抗原与参考血清自身HI效价的8倍(含8倍)或以上时，则认为待检病毒为该参考血清检测到的低反应株；反之，当相差8倍以内时(不含8倍)，则认为待检病毒与参考抗原的抗原性类似，为类似株。按照上述判断标准，本次实验所选的40株H3N2毒株与参考株相比，35%(14/40)为A/Kansas/14/2017的类似株，其余65%(26/40)为A/Kansas/14/2017的低反应株。

2.2 HA基因同源性分析 用MegAlign软件对研究分离的19株H3N2亚型流感毒株的HA基因核苷酸序列进行同源性分析，结果显示19株分离株HA核苷酸同源性为99.11%～100.0%，氨基酸同源性为98.93%～100.0%。将待检毒株与疫苗株HA基因序列比对，进行同源性分析。结果显示，2019—2020年山东省流感监测年度分离的H3N2流感毒株与当年推荐的疫苗株A/Kansas/14/2017之间的同源性相对与其他年份疫苗株的同源性较低。待检毒株与疫苗株之间核苷酸、氨基酸同源性分析及核苷酸遗传距离结果，见表1。从系统进化树可以看出，19株分离株与当季疫苗株A/Kansas/14/2017在进化树上的距离较远，而与2020—2021年疫苗株A/Hong Kong/2671/2019关系最近，且聚为一个支，全部属于3C.2a1b分支，见图1。

表1 19株H3N2亚型流感病毒流行株与疫苗株之间的HA基因同源性分析Tab.1 Homology analysis of the HA gene among 19 H3N2 subtype influenza virus epidemic strains and vaccine strains

▲：WHO推荐的2019-2020年疫苗株；●:WHO推荐的2020-2021年疫苗株；■：WHO之前推荐的疫苗株图1 2019-2020年山东省测序H3N2流感毒株HA基因进化树Fig.1 Phylogenetic tree of the HA genes of H3N2 influenza strains sequenced in Shandong Province from 2019 to 2020

2.3 HA基因氨基酸位点变异分析 H3N2亚型流感病毒HA1蛋白共有A、B、C、D和E 5个抗原决定簇。与疫苗株A/Kansas/14/2017相比较，参与分析的19株流行株均发生了抗原决定簇位点氨基酸替换，涉及4个抗原决定簇，其替换特征与疫苗株A/Hong Kong/2671/2019有相似，也有不同。所有的19株病毒在A区135位、137位、144位，B区159位、160位均不同于疫苗株A/Kansas/14/2017。此外在A区140位有2株，B区158位、198位各1株，C区53位有4株，D区207位有1株毒株有抗原决定簇位点发生突变。值得注意的是监测毒株A区135位、137位、144位，B区159位与最新疫苗株A/Hong Kong/2671/2019一致。E区未监测到变异发生。见表2。流感病毒受体结合位点位于HA1蛋白，由左壁(225～228位)、右壁(155位)、前壁(130～137位)、后壁(183位、190位、194位)和底壁(98位、153位)组成[5]。与当年疫苗推荐株A/Kansas/14/2017相比较，2019—2020年山东省H3N2流感病毒受体结合位点变异主要发生在前壁，所有毒株均出现T135K，S137F变异。

表2 2019-2020年山东省H3N2亚型流感毒株HA基因抗原性位点变异Tab.2 Antigenic variants in the HA gene of influenza A viruses (H3N2) in Shandong Province, 2019-2020

表2(续)毒株名称抗原决定簇ABCD13513714014415815916019853207A/Shandong-Bincheng/3250/2019KFISNYTSNKA/Shandong-Zichuan/330/2019KFISNYTSDKA/Shandong-Taishan/385/2019(H3)KFISNYTSDRA/Shandong-Dongying/1661/2019(H3)KFISNYTSNKA/Shandong-Donge/38/2019(H3)KFISNYTSNKA/Shandong-Rencheng/122/2020(H3)KFISNYTSDKA/Shandong-Yanzhou/339/2019(H3)KFISNYTSDKA/Shandong-Laiwu/324/2020(H3)KFMSNYTSDKA/Shandong-Mudan/1855/2019(H3)KFISNYTSNKA/Shandong-Zichuan/362/2019(H3)KFMSNYTSDKA/Shandong-Dongchangfu/1719/2019(H3)KFISNYTSDKA/Shandong-Zhifu/18/2020(H3)KFISNYTPDKA/Shandong-Shizhong/1887/2019(H3)KFISNYTSDKA/Shandong-Dongying/1672/2020(H3)KFISNYTSDKA/HongKong/2671/2019KFISNYISDK

2.4 糖基化位点分析 血凝素蛋白的糖基化位点增加或减少对流感病毒的抗原性及其他生物学特性均有一定影响。疫苗株A/Kansas/14/2017血凝素蛋白共有11个潜在糖基化位点，分别位于第8、22、38、45、63、122、133、165、246、285、483位。与疫苗株A/Kansas/14/2017相比，所有19株毒株在133位有糖基化位点缺失，但有17株毒株在158位点增加了糖基化位点。最新疫苗株A/Hong Kong/2671/2019在133和158位点都没有潜在糖基化位点。见表3。

表3 2019-2020年山东省H3N2亚型流感毒株HA糖基化位点变异情况Tab.3 Amino acid substitutions in HA gene glycosylation sites of influenza A viruses (H3N2) in Shandong Province, 2019-2020

表3(续)毒株名称8(NST)22(NGT)38(NAT)45(NSS)63(NCT)122(NES)133(NGT)158(NYT)165(NVT)246(NST)285(NGS)483(NGT)A/Shandong-Rencheng/122/2020∗∗∗∗∗∗-∗∗∗∗∗A/Shandong-Yanzhou/339/2019∗∗∗∗∗∗-∗∗∗∗∗A/Shandong-Laiwu/324/2020∗∗∗∗∗∗-∗∗∗∗∗A/Shandong-Mudan/1855/2019∗∗∗∗∗∗-∗∗∗∗∗A/Shandong-Zichuan/362/2019∗∗∗∗∗∗-∗∗∗∗∗A/Shandong-Dongchangfu/1719/2019∗∗∗∗∗∗-∗∗∗∗∗A/Shandong-Zhifu/18/2020∗∗∗∗∗∗-∗∗∗∗∗A/Shandong-Shizhong/1887/2019∗∗∗∗∗∗-∗∗∗∗∗A/Shandong-Dongying/1672/2020∗∗∗∗∗∗-∗∗∗∗∗A/HongKong/2671/2019∗∗∗∗∗∗--∗∗∗∗

3 讨 论

流感病毒在免疫选择压力下，通过HA和NA的碱基置换发生抗原进化，极易变异而引起不同程度的流行[6]。有研究表明，H3N2抗原的长期变异速率，比其他亚型流感病毒进化速率更快[7]。这使得季节性H3N2流感病毒更易引起局部的流行暴发，对易感人群的危害也更大。疫苗主要是通过诱导机体产生中和抗体起到对流感病毒的预防作用，但流感病毒可通过抗原漂移和抗原转换来对抗宿主的免疫反应，流感病毒的频繁变异导致WHO并不是每次都能准确预测疫苗株[8]。若是流感疫苗株对各亚型内抗原匹配较好，则产生较好的保护作用，对匹配程度较差的毒株保护效果则有限。不同地区流感疫苗免疫效果的研究结果显示，对于不匹配毒株，流感疫苗的保护作用普遍较差[9]。

自2009年以来，世界卫生组织全球流感监测网络根据HA基因序列将甲型流感H3N2病毒确定为7个基因组。近年来的研究表明，第3基因组H3N2流感病毒已占主导地位，并已形成亚群[10]。在本次研究中，随机选择的本地季节性H3N2流行毒株均为3C组，是目前全球流行的主要支系。3C组分为3C.1、3C.2、3C.3 3个亚组，它们在抗原性上总体是相似的，但有差异[10-11]。日本2014-2015年流感季，就是由于主要流行的是3C.2a基因型H3N2病毒，而疫苗株却是3C.1基因型，进而导致疫苗作用降低[12]。在2017年，3C.2a 基因亚群中又出现了进一步变异的集群[13]，与一些国家的疫苗免疫失败案例有关[9,14]。

本研究分析了2019年4月至2020年3月间山东省H3N2亚型流感病毒抗原性及血凝素基因特征，通过抗原性分析，发现仅35%的毒株为疫苗株类似株。这或许与此期间流行的H3N2流感病毒均是属于3C.2a亚群，而疫苗株属于3C.3a有关。通过序列比对还发现，本次实验所有入选监测毒株的HA抗原与疫苗株相比较均出现了5处抗原表位的变异，2处位于前壁的受体结合位点氨基酸发生变异。通常认为，如果抗原决定簇中的4个以上位点发生突变，且这些位点分布在2个以上的抗原决定簇上时，表明新的抗原漂变株出现[15]，这时疫苗株的接种就可能会失去对流行株的保护。此外，血凝素蛋白糖基化位点可以稳定蛋白结构，其数目的增减会影响中和抗体与HA抗原表位的结合，从而使病毒逃避宿主免疫识别，进而影响病毒的抗原性、传染性和致病性[16]。本研究中所有毒株与2019—2020年疫苗株相比发生1处糖基化位点缺失(19/19)，1处糖基化位点增加(17/19)，这也提示我们还要进一步对甲型H3N2流感病毒流行株与疫苗株的抗体进行有效的评价。

本研究发现，2019—2020年山东省甲型H3N2流感流行株与疫苗株在抗原表位、受体结合位点及糖基化位点等存在差异，提示2019—2020年山东省H3N2亚型流感病毒抗原性可能发生了转变，同时WHO推荐的2019—2020年北半球疫苗株保护性可能不太理想。本研究从分子水平提高了流感监测的敏感性，及时对山东省甲型H3N2流感病毒HA基因的变异情况进行监测，可为疫苗株的筛选提供参考，同时也为今后山东省的流感防控和分子生物学监测提供依据。