郑月华 韩雪 汤磊磊

脑卒中是全球成年人致残、致死的主要原因之一，世界范围内成年人群脑卒中的发病率为25%，而我国则高达39%[1]。缺血性脑卒中是脑卒中中最主要的类型，占69.6%～77.8%[2]，目前临床上最为有效的治疗方式是药物溶栓治疗，如重组组织型纤溶酶原激活物（rt-PA）。但rt-PA治疗时间窗狭窄，可使脑内出血转化风险增加，限制了其临床应用[3]。而脑缺血再灌注（cerebral ischemic/reperfusion,I/R）过程会对脑组织造成二次损伤，导致脑水肿或出血，甚至破坏血脑屏障，因此神经保护剂被认为是治疗缺血性卒中更有潜力的药物。

榄香烯是从我国传统中药姜科植物莪术中提取出来的一种中药单体，已在临床应用于广谱恶性肿瘤的治疗[4]。研究表明榄香烯可降低脑缺血小鼠脑组织炎症因子水平，在小鼠全脑缺血模型中亦可通过抗凋亡机制改善急性期神经损伤[5-6]。榄香烯虽然在脑血管病的治疗中取得较好疗效，然而其在脑缺血慢性期的作用及相关机制并不明确。研究证实氧化应激、炎症、凋亡和自噬等病理事件参与了脑I/R损伤的病理生理过程，最终导致神经细胞死亡[7]。因此，寻找针对多种机制进行干预的神经保护剂是治疗脑缺血的有效策略。本研究以脑缺血大鼠为研究对象，探讨榄香烯对脑I/R慢性损伤的保护作用及相关机制，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器 榄香烯乳注射液（规格：0.1 g∶20 ml；批号：20190402）购自大连金港制药有限公司；4%多聚甲醛（批号：190203）购自上海酶联生物公司；HE试剂盒购自美国Richard-Allan Scientific公司；TTC染色液（批号：BCCC3620）购自美国Sigma公司；原位末端标记法（TUNEL）试剂盒（批号：31124）购自美国 Roche公司；苯甲酰磺酰氟（PMSF）和RIPA组织裂解液均购自上海康成生物科技有限公司；BCA蛋白定量试剂盒、脱脂奶粉、5×蛋白上样缓冲液和ECL超敏化学发光液均购自武汉谷歌生物科技有限公司；B细胞瘤-2（Bcl-2）抗体、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）抗体、GAPDH抗体、辣根过氧化物酶-羊抗兔IgG二抗和辣根过氧化物酶-羊抗鼠IgG二抗均购自中国武汉proteintech生物技术有限公司；微管相关蛋白轻链3（LC3）抗体购自美国Sigma公司；p62抗体购自美国Abcam公司。Leica切片仪（型号：EMUC7）和倒置相差显微镜（型号：DMI3000B）均购自德国Leica公司；化学成像分析仪（型号G:BOX）购自英国Syngene公司。

1.2 实验动物、建模及分组 48只清洁级SD雄性大鼠，体重（220±20）g，购自杭州医学院实验动物中心，实验动物生产许可证号SCXK（浙）2019-0002。饲养条件：温度（22±3）℃，相对湿度 45%～65%，通风换气10～15次/h，昼/夜各12 h光照周期循环。动物可自由饮食、饮水。实验动物使用许可证：SYXK（浙）2019-0011。采用随机数字表法将SD大鼠分为榄香烯低剂量组（1 mg/kg）、榄香烯高剂量组（10 mg/kg）、模型组和假手术组，每组12只。大鼠大脑中动脉阻断（middle cerebral artery blockage，MCAO）模型建立参照文献[8]。榄香烯低剂量组、榄香烯高剂量组和模型组大鼠用10%水合氯醛（400 mg/kg）腹腔注射麻醉，仰卧固定于泡沫板上，剃去颈部毛发，75%乙醇溶液消毒，沿颈正中线切口，分离肌肉和筋膜，分离暴露颈总、颈外和颈内动脉。用动脉夹暂时夹闭颈内动脉，结扎颈总动脉近心端和颈外动脉，在颈总动脉分叉下方4 mm处剪一小口，将线栓（长4 cm，直径0.25 mm）从开口处插入，插入颈内动脉17～18 mm且遇到有轻微阻力感为止，结扎颈内和颈总动脉远心端以固定线栓，缝合皮肤。缺血90 min后，拔出线栓再灌注14 d。假手术组大鼠仅暴露颈内外动脉分支，不闭塞大脑中动脉。术后大鼠置于电热毯上维持体温36.5～37.5℃。榄香烯溶于0.2 ml 0.9%氯化钠注射液，腹腔注射，手术当天起连续给药14 d，1次/d，首次给药时间为术前30 min；模型组和假手术组大鼠腹腔注射0.2 ml 0.9%氯化钠注射液。

1.3 方法

1.3.1 大鼠神经功能缺损评分测定 采用Longa等[8]报道的评分标准，各组随机取6只大鼠在给药14 d后进行评分。评分标准：未见明显异常为0分；将大鼠尾巴提起后其对侧前爪不能完全伸展为1分；大鼠向对侧转圈为2分；大鼠损伤侧瘫痪或倾倒，出现重度神经功能损伤为3分；大鼠无自发性走，意识丧失为4分。

1.3.2 大鼠脑梗死体积检测 上述每组6只大鼠行TTC染色。大鼠麻醉后，进行0.9%氯化钠溶液心脏灌流，待血液完全流尽后断头取脑，剔除嗅球、小脑和低位脑干，-20℃冷冻20 min后沿冠状面切成厚度约2 mm的5张切片，并置于2%TTC染色液中充分浸泡，37℃避光孵育30 min，再置于4%多聚甲醛溶液中固定过夜，取出切片进行拍照。染色呈红色为正常脑组织，白色为梗死组织。采用Image J图像分析软件测量脑梗死体积。脑梗死面积（%）=（5片大脑非缺血侧梗死面积－5片大脑缺血侧未梗死面积）/5片大脑脑总面积×100%。脑梗死面积乘以厚度（2 mm）后即为脑梗死体积[9]。

1.3.3 大鼠脑组织皮层神经元形态观察 每组再随机抽取3只大鼠，处死方法同上，取出脑组织后置于4%多聚甲醛室温固定24 h，梯度乙醇溶液脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。4 μm厚度切片，HE染色后在光学显微镜下观察皮层组织并拍照。

1.3.4 大鼠脑组织皮层神经元凋亡数检测 采用TUNEL染色。将上述各组3只大鼠脑组织石蜡切片用抗神经元核抗体4℃孵育过夜，PBS清洗3遍，TUNEL试剂37℃孵育1 h，在显微镜下观察并拍照，用Image J图像分析软件计算皮层神经元凋亡数。

1.3.5 Bcl-2、Caspase-3、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、p62 表达水平检测 采用Western blot法。每组剩余的3只大鼠同上述方法处死后取出脑组织，用镊子小心分离出大脑皮层组织，立即冻存于-80℃冰箱。检测时取出样本置于冰上融化，称取100 mg皮层组织放入含PMSF的500 μl裂解液中，加入钢珠，在研磨器上震荡研磨，90 Hz，60 s，裂解后的组织12 000 r/min、4℃离心15 min，收集上清液。每组上样30 μg，聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶（SDSPAGE）电泳分离蛋白，转至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，5%脱脂奶粉封闭 1 h，分别加入 Bcl-2（1∶1 000）、Caspase-3（1∶800）、LC3B（1∶800）、p62（1∶800）和 GAPDH（1∶1 000）一抗在4℃摇床孵育过夜，三乙醇胺+Tween缓冲盐溶液（TBST）清洗3次，每次5 min。加入二抗（1∶3 000）室温孵育1.5 h，使用TBST清洗3次，每次5 min。在暗室中使用ECL显色后用化学成像分析仪获取蛋白条带，GAPDH作为内参，使用Image J软件进行灰度值分析。

1.4 统计学处理 采用Prism 8.0统计软件。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4组大鼠神经功能缺损评分比较 与假手术组相比，模型组大鼠神经功能缺损评分明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组相比，榄香烯低剂量和高剂量组大鼠神经功能缺损评分均明显降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。见表1。

表1 4组大鼠神经功能缺损评分比较（分）

2.2 4组大鼠脑梗死体积比较 与假手术组相比，模型组大鼠脑梗死体积明显增大，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组相比，榄香烯低剂量和高剂量组大鼠脑梗死体积均明显缩小，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。见表2和图1（插页）。

表2 4组大鼠脑梗死体积比较（%）

图1 4组大鼠脑梗死体积TTC染色图（a：假手术组；b：模型组；c：榄香烯低剂量组；d：榄香烯高剂量组）

2.3 4组大鼠脑组织皮层神经元形态比较 HE染色结果显示，除假手术组外，模型组、榄香烯低剂量组和榄香烯高剂量组大鼠脑组织皮层神经元均出现细胞核固缩、不规则，碎片化。与模型组相比，榄香烯低剂量组和榄香烯高剂量组大鼠脑组织皮层神经元细胞核畸形有所改善。见图2（插页）。

图2 4组大鼠皮层神经元形态HE染色图（a：假手术组；b：模型组；c：榄香烯低剂量组；d：榄香烯高剂量组；黑色箭头指示畸形神经元，标尺：100 μm；×200）

2.4 4组大鼠脑组织皮层神经元凋亡数比较 TUNEL染色结果显示，与假手术组相比，模型组大鼠皮层神经元核固缩明显，呈碎片状、深棕色颗粒，神经元凋亡数明显增加，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组相比，榄香烯低剂量组和榄香烯高剂量组大鼠脑组织皮层神经元凋亡数均呈不同程度降低，差异均有统计学意义（均P＜0.01）。见表3和图3（插页）。

图3 4组大鼠皮层神经元TUNEL染色图（a：假手术组；b：模型组；c：榄香烯低剂量组；d：榄香烯高剂量组；黑色箭头指示凋亡的神经元，标尺：100 μm；×200）

表3 4组大鼠皮层神经元凋亡数比较（个）

2.5 4 组大鼠脑组织 Bcl-2、Caspase-3、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、p62表达水平比较 与假手术组相比，模型组Bcl-2、p62表达水平均明显下调，Caspase-3表达水平、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明显上调，差异均有统计学意义（均P＜0.01）；与模型组相比，榄香烯高剂量组Bcl-2表达水平明显上调，榄香烯高剂量和低剂量组Caspase-3表达水平、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均明显下调，p62表达水平均明显上调，差异均有统计学意义（均P＜0.01）。见图4、5和表4。

表4 4组大鼠凋亡和自噬蛋白表达水平比较

图4 4组大鼠皮层凋亡蛋白表达的电泳图（a：假手术组；b：模型组；c：榄香烯低剂量组；d：榄香烯高剂量组；Caspase-3为半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3；Bcl-2为B细胞瘤-2）

图5 4组大鼠皮层自噬蛋白表达的电泳图（a：假手术组；b：模型组；c：榄香烯低剂量组；d：榄香烯高剂量组；LC3为微管相关蛋白轻链3）

3 讨论

脑卒中是指脑内动脉狭窄、闭塞或破裂造成脑血液循环障碍的一种神经性疾病，目前研究主要集中于缺血性脑卒中。针对缺血性脑卒中的治疗策略，首选溶栓治疗。然而，临床缺血性脑卒中的溶栓率和rt-PA的使用率均很低[10]，目前尚缺乏有效治疗脑缺血的神经保护药物。因此，深入探索缺血性脑卒中的发病机制，寻找治疗脑缺血的有效措施具有积极的意义。

莪术作为姜科植物的根茎，具有行气破血、消积止痛的功效，榄香烯是其挥发油中提取的单体[11]，它是我国自行开发研制的国家级二类广谱抗肿瘤新药，在临床上常用作抗肿瘤辅助药物。榄香烯静脉或口服给药后，均有部分药物可通过血脑屏障进入脑组织[12]。研究表明，榄香烯通过抗炎和抗凋亡机制可改善全脑缺血急性损伤[6]，榄香烯还可通过调节小胶质细胞RAC1蛋白/蛋白激酶3/p38信号通路改善败血症诱导的小鼠脑损伤，提高学习记忆能力[13]。另有研究也发现，100 mg/kg榄香烯能显著改善外伤性脑损伤鼠神经功能评分[14]。本研究采用MCAO模型大鼠缺血1.5 h再灌注14 d，结果显示经榄香烯处理能显著提高脑I/R 14 d后神经功能评分，减少脑梗死体积；而从形态学观察发现，榄香烯可改善大脑皮层神经元损伤情况。本研究结果提示，榄香烯对MCAO模型大鼠慢性损伤具有神经保护作用。

脑缺血再灌注引发了一系列缺血级联反应，最终触发神经元凋亡和神经功能损伤。研究表明兴奋性毒性、凋亡、自噬和炎症作为脑I/R的关键分子事件，在正向反馈中触发彼此，参与脑缺血损伤病理过程[15]，靶向这些机制显示出良好的神经保护作用。脑缺血后数小时称为急性期，主要病理过程为神经元损伤和炎症反应；脑缺血慢性期出现在缺血后数天至数月，本研究采用大鼠I/R 14 d作为脑缺血慢性期模型，持久的缺血触发神经元自噬上调，可诱导细胞发生自噬性死亡[16-17]。在小鼠持续性MCAO模型中缺血诱导小胶质细胞自噬，造成脑损伤，自噬抑制剂3-MA可显著减少脑梗死、脑水肿和神经功能缺陷，提示过度自噬参与了脑缺血损伤过程[18]。研究发现榄香烯可通过调节磷脂酰肌醇-3-羟激酶/苏氨酸激酶/雷帕霉素靶蛋白信号通路诱导人非小细胞肺癌细胞A549发生保护性自噬[19]，表明榄香烯参与自噬活性的调节，然而其在脑缺血慢性损伤中对自噬的影响还不明确。泛素结合蛋白p62在靶向错误折叠的蛋白通过自噬溶酶体途径降解，在抑制线粒体凋亡和氧化应激方向发挥重要作用。p62与LC3相结合形成复合物，通过氮端的PB1结构域与LC3-Ⅱ结合，参与自噬小体的形成，并在自噬溶酶体中降解，引发自噬，因此两者可以看作自噬体的标记蛋白[20]。本研究发现，榄香烯能够显著抑制脑I/R 14 d后大鼠皮层LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值，提高p62表达水平，提示榄香烯发挥神经保护作用与抑制过度自噬有关。

大量证据表明氧化应激和细胞凋亡是缺血性脑卒中病理生理学中常见的现象，凋亡细胞特征性改变包括细胞皱缩、核破裂和DNA片段化等。Bcl-2及其家族成员是最强大的死亡抑制蛋白之一，并且抑制Caspase-依赖性和Caspase-非依赖性细胞死亡[21]。有研究显示抑制Caspase-3激活可减少鼠MCAO模型脑梗死体积[22]。榄香烯能够降低大鼠脑外伤诱导的细胞凋亡，减少TUNEL阳性细胞和Caspase-3表达[14]。本研究结果发现榄香烯可上调Bcl-2表达水平，下调Caspase-3水平，从而显著减少脑I/R损伤后皮层神经元TUNEL阳性细胞数。以上结果提示榄香烯的神经保护作用是通过抑制过度自噬和凋亡实现的。

综上所述，榄香烯处理可能通过抑制大鼠脑I/R 14 d后皮层过度自噬和凋亡，而发挥神经保护作用。本研究为脑缺血的治疗提供新的研究思路，但榄香烯调控自噬和凋亡的具体分子机制尚需进一步探索。