柏 玲,陈 晨

工作压力的增大、环境有害物质的增加等多种因素作用，使女性卵巢功能损伤、生育能力下降的问题逐渐显现，亟待解决[1]。颗粒细胞是卵泡发育和闭锁过程中最重要的参与细胞,通过与卵泡膜相互作用以维持正常的卵巢功能[2]。研究中我们发现miR-223在卵巢颗粒细胞中表达，文献资料显示miR-223与IGF-1R基因存在靶向调控作用[3]，目前尚无miR-223通过靶向下调IGF1R-AKT/mTOR通路对卵巢颗粒细胞增殖及其凋亡产生影响的文献资料报道，为进一步验证这一假设，我们设计了本次研究，报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料：本研究于2019年6月-2019年12月在宁夏医科大学生育力保持教育部重点实验室完成，人卵巢颗粒细胞购自ATCC公司，miR-223慢病毒购自VectorBuilder公司，蛋白抗体购自北京博奥森生物技术有限公司(IGF1R兔抗人抗体，bs-4985R；p-S6K1兔抗人抗体，bs-5669R；p-4EBP1，bs-14550R;山羊抗兔二抗，bs-0295G-HRP)。实验依据细胞处理方式分为以下3组：①正常对照组为细胞常规培养；②慢病毒对照治疗组为正常对照组细胞转染对照慢病毒；③miR-223 Mimics组(Mimics组)为正常对照组细胞转染miR-223 Mimics慢病毒，各组细胞于慢病毒转染72 h后收集细胞进行后续实验，每组3个重复。

1.2 细胞培养：SVOG细胞培养液为1 640培养液+10%胎牛血清+1%双抗。培养条件：37 ℃恒温培养箱，95%空气+5%二氧化碳。细胞融合80%左右按1∶3进行传代。

1.3 CCK8细胞增殖检测：采用0.25%胰酶消化收集各组细胞，细胞计数板计数，然后将上述各组细胞分别接种于96孔板中，每空104个细胞，每组3个重复。接种后0、24、48 h加入100 μl含10% CCK8工作液的完全培养液，37 ℃培养箱孵育2h后，取出96孔板，采用酶标仪检测各孔细胞OD值。

1.4 Western Blot检测：采用0.25%胰酶消化收集各组细胞，参照全蛋白提取试剂盒(凯基KGP250)操作流程提取各组细胞蛋白，BCA蛋白检测试剂盒(凯基KGPBCA)检测蛋白浓度，配置SDS凝胶，每组蛋白上样量30 μg，电泳、转膜，3% BAS封闭1 h，4 ℃一抗孵育过夜(IGF1R,1∶1 000；p-S6K1,1∶1 000；p-4EBP1,1∶1 000)。第2天洗膜，二抗(1∶5 000)室温孵育1 h，再洗膜，ECL发光检测，蛋白表达检测采用ImageJ软件检测条带灰度值后进行统计学分析，每个样本重复3次。

1.5 流式细胞仪细胞周期检测：0.25%胰酶消化收集各组细胞，细胞计数板计数，每组分别取106个细胞，75%乙醇固定过夜，PBS溶液离心洗涤3次(800 g，5 min)，采用细胞周期检测试剂盒(凯基KGA511)配置PI/RNase A 染色工作液，每个样本加入500工作液，4 ℃避光孵育30 min，流式细胞仪上机检测，每组3个重复。

1.6 Q-PCR检测：0.25%胰酶消化收集各组细胞，参照Trizol总RNA提取试剂(凯基KGA1203)操作说明提取各组细胞RNA，检测RNA浓度，逆转录，采用ABI 7500荧光定量PCR进行检测。各基因PCR用2-△△CT计算各基因RNA的相对表达量，见表1。

表1 各基因Q-PCR序列信息

2 结果

2.1 人卵巢颗粒慢病毒转染效果：慢病毒转染后Q-PCR检测，miR-223表达量正常对照为(1.00±0.091)，慢病毒对照组为(0.997±0.123)倍，Mimics组为(3.857±0.215)倍，Mimics组miR-223表达显著上调(F=351.87，P<0.05)，Mimics组与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。

2.2 各组细胞CCK8细胞增殖检测:CCK8细胞增殖检测结果显示,Mimics细胞24、48 h OD值与正常对照组比较差异具有统计学意义(t24=14.86，t48=27.26，P<0.05),见表2。

表2 各组细胞CCK8细胞增殖检测比较

2.3 各组细胞周期分析：流式细胞仪细胞周期分析结果显示，Mimics组细胞与正常对照组比较差异有统计学意义，其中Mimics组G1期细胞比例高于对照组，S期、G2期细胞比例低于正常对照组，差异具有统计学意义(tG1=15.09，tS=6.39，tG2=28.88，P<0.05)，见表3。

表3 各组细胞周期分布比较

2.4 各组细胞凋亡检测:流式细胞仪检测各组细胞凋亡率，Mimics组细胞凋亡率高于正常对照组，差异具有统计学意义(t=17.45，P<0.05)，见表4。

表4 各组细胞凋亡率比较

2.5 IGF1R-AKT/mTOR通路基因Western-Blot、Q-PCR检测：IGF1R-AKT/mTOR通路基因Western-Blot、Q-PCR检测结果显示Mimics组IGF1R基因mRNA、蛋白表达较正常对照组下调，差异具有统计学意义(tmRNA=36.93，t蛋白=11.16，P<0.05),且p-S6K1、p-4EBP1蛋白含量较正常对照组减少(tp-S6K1=10.55，tp-4EBP1=9.55，P<0.05)，见图1(目录后)。

3 讨论

生殖衰老是困扰现代女性的一大问题,女性生育力随着年龄增长逐渐下降,在30岁后尤为显著,在35～40岁下降加速,至45岁几乎降为零[4]。卵巢功能及其微环境稳态与女性生殖衰老息息相关,卵巢颗粒细胞的生长分化恰恰是卵泡的主要构成成分，颗粒细胞表面包含大量受体且能够分泌雌激素、孕激素等多种具有生物活性的激素，进而促进原始卵泡启动、生长为成熟卵泡[5]。有研究发现，卵巢颗粒细胞的异常凋亡或是其基因表达异常，与多囊卵巢综合征患者卵泡发育障碍及雄激素水平异常及卵巢早衰密切相关[6]，为此卵泡中颗粒细胞数量及其功能对女性生殖功能具有重要影响[7]。

miRNA为人体内相对保守的内源性非编码RNA,其参与调控基因组中半数以上功能基因的表达，miRNA通过与靶基因转录产物mRNA的3’-UTR结合,引起靶mRNA的降解进而阻碍靶基因翻译，肿瘤学研究表明miRNA参与所有恶性肿瘤的发生、发展、侵袭和转移等过程[8]。胰岛素样生长因子1 (IGF-1R) 是一种多肽类生长因子,IGF-1R在细胞生长、分化、转移、凋亡等多种生命活动中扮演着重要角色[9]。相关研究表明，IGF1R所含的酪氨酸激酶结构域可以激活下游的PI3K/AKT/mTOR通路，该通路通过促进其下游底物S6K1蛋白和4EBP1蛋白磷酸化,进而增强细胞蛋白质的合成,促进细胞的增殖、迁移和抑制细胞凋亡[10-11]。

本次研究发现人卵巢颗粒细胞中上调miR-223表达，颗粒细胞增殖受到抑制，细胞出现G1期阻滞，同时颗粒细胞凋亡率增加，Western-Blot、Q-PCR检测结果显示上调miR-223表达，IGF1R基因mRNA、蛋白表达均下调，同时mTOR通路下游p-S6K1、p-4EBP1蛋白含量减少，说明IGF1R-AKT/mTOR通路活性被抑制。

综上所述，本研究验证了miR-223通过靶向下调IGF1R基因表达进而下调AKT/mTOR信号通路抑制卵巢颗粒细胞增殖及促进凋亡。研究为卵巢颗粒细胞损伤的相关机制研究提供了新的思路。