殷先元，蒲宇辰，黄 颖，黄 斌，侯有明*

(1.福建农林大学闽台作物有害生物生态防控国家重点实验室，福州 350002；2.福建省昆虫生态重点实验室，福州 350002；3.湖北省农业科学院植保土肥研究所，农业农村部华中作物有害生物综合治理重点实验室，武汉 430064；4.闽南师范大学生物科学与技术学院，福建漳州 363000)

黄曲条跳甲Phyllotretastriolata(Fabricius)隶属于鞘翅目Coleoptera叶甲科Chrysomelidae，是专门为害十字花科蔬菜的寡食性害虫(Beranetal., 2011)，也是十字花科蔬菜上危害最为严重的世界性害虫之一(Andersenetal., 2006)，在我国分布范围广泛，尤其在我国广东和福建两地危害严重，严重制约了蔬菜生产(贺华良等, 2012a)。黄曲条跳甲成虫寿命长，繁殖力强，为害状严重(贺华良等, 2012b)，并对多种化学药剂产生抗性难以防治，急需寻找新的替代防治方法(Fengetal., 2000; Yanetal., 2013)。

苏云金芽胞杆菌Bacillusthuringiensis(Berliner)(简称Bt)对鳞翅目、双翅目、鞘翅目等多种昆虫幼虫具有高效杀虫活性，广泛用于防治农林业害虫(Rohetal., 2007)，是重要的生防菌(Groveetal., 2001)。Bt制剂浇淋土壤可以减少黄曲条跳甲产卵量和幼虫数量，对成虫的防效可达67.56%(胡珍娣等，2012)。杨建云等(2013)研究表明Bt工程菌施用后72 h可造成黄曲条跳甲幼虫的校正死亡率为41.67%，并抑制黄曲条跳甲卵的孵化。同时，研究表明，苏云金芽胞杆菌能够影响昆虫成虫的生长发育(Yamaguchietal., 2008, 2013; Zhangetal., 2013; Wangetal., 2016)。西方玉米根虫Diabroticavirgifera(LeConte)成虫取食表达Cry3Bb1蛋白的转基因玉米叶片后，雄虫的存活率减少，雌虫的体重和产卵量均下降(Meissleetal., 2011)。Qi等(2011)研究表明BtZQ-89菌株对云斑天牛Batocerahorsfieldi(Hope)成虫的校正死亡率可达55.33%，同时使成虫的体重和卵孵化率分别减少2.22%和19.62%。

苏云金芽胞杆菌是否能直接用于防治黄曲条跳甲成虫？本研究基于苏云金芽胞杆菌HA和HD这两个菌株，其中苏云金芽胞杆菌HA对红棕象甲Rhynchophorusferrugineus(Olivier)2龄幼虫具有较好的杀虫活性(Puetal., 2017)，而苏云金芽胞杆菌HD对黄曲条跳甲幼虫也表现出杀虫活性(吉亮等, 2016)。本文通过测定苏云金芽胞杆菌HA和HD对黄曲条跳甲成虫的毒力，分析不同Bt菌株对谷胱甘肽-S-转移酶(GST)活性的影响，并利用透射电镜观察对比HA和HD对黄曲条跳甲中肠的影响，最终综合判断HA和HD两株苏云金芽胞杆菌用于防治黄曲条跳甲成虫的价值，并分析其在黄曲条跳甲成虫中肠中的作用机理。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试菌株：苏云金芽胞杆菌HA和HD(记为菌株Bt-HA和Bt-HD)，来自华中农业大学微生物学国家重点实验室孙明教授课题组。

供试蔬菜：上海青(福州金铭种业有限公司)，实验室内标准化种植，整个生长周期内不喷施任何杀虫剂。

供试昆虫：黄曲条跳甲成虫分别于采集于福建省建瓯市西大街外的菜地。经室内用上海青饲喂48 h后备用。

供试药剂：Bradford法蛋白定量试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)，谷胱甘肽-S-转移酶测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 试验方法

1.2.1毒力测定

分别用含0.1%吐温-80的无菌水将Bt-HA粉剂稀释成1.51×108、3.03×108、6.05×108、1.21×109、2.42×109CFU/mL，Bt-HD粉剂稀释成7.46×107、1.49×108、2.99×108、5.97×108、1.19×109CFU/mL 5种等比浓度。以含0.1%吐温-80的无菌水溶液为空白对照组。以新鲜洗净的上海青叶片，剪成正方形(3×3 cm)，将叶片分别浸渍于Bt-HA、Bt-HD菌悬液和对照组溶液中，25 min后取出叶片，在滤纸上自然晾干。将叶片放入垫有湿润滤纸的塑料培养皿中(D=70 mm)，每皿放入5片叶片，罩上塑料瓶。在温度28℃±1℃，相对湿度75%±5%,光周期L∶D=14∶10的环境条件下，接入饥饿处理24 h的黄曲条跳甲成虫约30头，每2 d更换一次叶片，连续喂毒14 d，每天检查成虫的死亡数，每个处理重复4次。采用Abbott公式计算校正死亡率(Abbott, 1987)。

1.2.2GST酶活性测定

试虫准备：同1.2.1。设Bt-HA、Bt-HD和空白对照3个处理，Bt-HA和Bt-HD菌悬液浓度为4.01×108CFU/mL，黄曲条跳甲成虫饥饿处理24 h后接入，每天更换对应处理的叶片，每一处理分别于接虫后1、4、7和14 d取30头黄曲条跳甲成虫，共12个样。样本放入-80℃冰箱中冷冻保存备用。

酶活性测定：从-80℃冰箱中取出试虫，每个样5头，装入1.5 mL EP管中，每管加入 500 μL 0.02 M PBS(pH 7.4)缓冲液，并放入3颗锆珠进行组织研磨(65 Hz，60 s)。研磨后于4℃下10 000 rpm离心10 min，取上清液作为酶源。每个样重复3次，采用Bradford法测定酶源蛋白含量，GST酶活性测定按照说明书进行。

1.2.3中肠组织病理学观察

黄曲条跳甲成虫的处理方法同1.2.2。分别于取食叶片4 d和14 d时取样，3种处理各取5头黄曲条跳甲成虫。成虫用冰麻醉后解剖，截取小段中肠，用0.15 M NaCl洗净后，放入2.5%戊二醛溶液中，进行透射电镜观察。

1.3 数据处理与分析

实验数据由SPSS 21.0进行统计分析。菌株Bt-HA和Bt-HD毒力与GST酶活性数据采用ANOVA分析，Turkey HSD进行多重比较；Probit机率值法计算致死中浓度LC50和线性回归方程。

2 结果与分析

2.1 菌株Bt-HA和Bt-HD对黄曲条跳甲成虫的毒力测定

Bt-HD对黄曲条跳甲成虫的毒力强于Bt-HA，LC50分别为1.17×108CFU/mL和4.01×108CFU/mL(表1)。

表1 菌株Bt-HA和Bt-HD对黄曲条跳甲成虫的致死中浓度

2.2 菌株Bt-HA和Bt-HD对黄曲条跳甲GST酶活性影响

在1～14 d内，随着时间的延长，对照组体内的GST酶活性呈显著性下降(F3,8=16.652,P=0.001)；Bt-HA处理组的黄曲条跳甲GST酶在第4天时与对照组并没有显著差异，第7天活性显著上升达到峰值，后显著性降低(F3,8=6.066,P=0.019)，而Bt-HD处理的黄曲条跳甲GST酶在第4天活性达到峰值，随后呈下降趋势(F3,8=2.732,P=0.114)(图1)。

图1 不同处理的黄曲条跳甲体内GST酶活性的时间变化动态

同时，Bt-HD处理组的黄曲条跳甲体内GST酶活性始终高于取食菌株Bt-HA处理组和对照组叶片的黄曲条跳甲体内GST酶活性。

2.3 菌株Bt-HA和Bt-HD对黄曲条跳甲成虫中肠组织形态的影响

电镜观察结果表明，取食处理叶片4 d后，Bt-HD处理组的黄曲条跳甲成虫中肠微绒毛开始疏松脱落(图2-C)，对照组和菌株Bt-HA处理组的中肠微绒毛致密且排列整齐，形态未见变化(图2-A和2-B)；取食处理叶片14 d后，菌株Bt-HD处理组的黄曲条跳甲成虫中肠柱状细胞的底膜变形脱落(图3-C)，菌株Bt-HA处理组的中肠微绒毛开始肿胀脱落(图4-B)，但底膜与基质结合紧密且形态完整(图3-B)，对照组中肠底膜和微绒毛形态完整，未见明显变化(图3-A和图4-A)。这表明Bt-HA和Bt-HD皆能损伤黄曲条跳甲成虫中肠的微绒毛，并且Bt-HD能使中肠的底膜变形脱落，对中肠的损伤更为明显。

图2 取食3种不同处理叶片4 d后黄曲条跳甲成虫中肠微绒毛的形态变化

图3 取食3种不同处理叶片14 d后黄曲条跳甲成虫中肠柱状细胞底膜的形态变化

图4 取食菌株Bt-HA处理的叶片14 d后黄曲条跳甲成虫中肠微绒毛的形态变化

3 讨论与结论

本研究结果表明，苏云金芽胞杆菌Bt-HA和Bt-HD对黄曲条跳甲成虫都具有杀虫活性，且Bt-HD对黄曲条跳甲成虫的毒力比Bt-HA强。用Bt-HA或Bt-HD处理黄曲条跳甲成虫时都会触发黄曲条跳甲的解毒机制，引起GST酶表达量上升。昆虫体内的解毒酶包括羧酸酯酶、乙酰胆碱酯酶、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)等，能够代谢大量的外源毒素(任羽等, 2016)。小地老虎AgrotisypsilonRottemberg幼虫在遇到相同剂量的BtCry2Ab和Cry1Ac毒蛋白时，毒性更高的Cry2Ab引起小地老虎幼虫体内GST酶活性显著升高，而Cry1Ac对GST酶活性的影响不明显(陆琼等，2009)，所以昆虫体内GST酶活性与底物的毒性相关。谭树乾等(2013)发现在华北大黑鳃金龟Holotrichiaoblita幼虫中GST酶活性与毒蛋白Cry8Ga1的浓度呈正相关。本文研究结果表明，毒性更高的Bt-HD会引起黄曲条跳甲强烈的防御反应，体内GST酶活性显著上升，并且高于Bt-HA处理组。

昆虫摄取Bt毒蛋白后，Bt毒蛋白与中肠上皮细胞上的受体结合，进而穿孔，引起细胞渗透压改变，导致昆虫死亡(Vachonetal., 2012)。在组织病理学上表现为Bt毒蛋白造成昆虫中肠微绒毛的肿胀脱落、中肠上皮细胞的肿胀和空泡化、肠腔空泡化、细胞内容物外泄等(Endo and Nishiitsutsuji-Uwo, 1980; 李芳芳等, 2007; Bowlingetal., 2017)。本研究表明，苏云金芽胞杆菌对黄曲条跳甲成虫造成毒性的机制之一是Bt毒蛋白会对其中肠的组织形态造成损伤。苏云金芽胞杆菌Bt-HA和Bt-HD皆能造成黄曲条跳甲成虫中肠微绒毛脱落，其中Bt-HD作用速度更快并能使中肠柱状细胞底膜变形脱落，这与Bt-HD毒性更强相一致。

综上所述，苏云金芽胞杆菌HD具有用于田间防治黄曲条跳甲成虫的应用前景，有关苏云金芽胞杆菌HD对黄曲条跳甲成虫的杀虫作用机理还需进一步探索。