何敏 王秀璞 李彦 戴志聪 王从彦 杜海 杜道林

摘 要：为了从青藏高原北部（简称藏北）退化草原的土壤中分离筛选可以促进当地典型牧草生长的促生菌株，以促进藏北植被修复。该文通过采用稀释涂平板的方法，分离耐低温植物促生菌株，并结合盆栽试验设计，评估分离细菌对当地牧草生长的影响。结果表明：（1）从西藏土壤中成功筛选得到两株耐低温细菌TS22和TS27，经16S rRNA基因鉴定分别属于Brevibacterium sp.和Bacillus mycoides。（2）通過离体评估两株分离菌植物促生属性的结果显示，菌株TS22和TS27均具有产生IAA、SID的能力和ACC-脱氨酶活性，TS22具有较高的ACC-脱氨酶活性（264.69 nmol·α-KB mg-1·h-1），TS27显示出较强的产IAA[（7.52±3.85）mg·L-1]和SID（92%）的能力。（3）盆栽试验显示，在10 ℃低温环境下，菌株TS22和TS27对早熟禾和老芒麦生长的影响因植物和菌种的不同而有所不同;菌株TS22在株高、根长、地上和地下干重方面显著促进了早熟禾的生长，且促生能力优于TS27。该研究结果为植物-微生物技术在藏北高寒地区植被恢复中的使用提供了很好的菌种资源和实践基础。

关键词：植物促生菌，低温环境，耐低温菌，植物促生属性，植物修复，草原退化

中图分类号：Q945

文献标识码：A

文章编号：1000-3142（2021）09-1425-08

Abstract：The objective of this study was to screen cold-tolerant plant growth-promoting bacteria （PGPB）for local typical grass in Northern Tibetan Plateau. The serial dilution plating method was used to isolate the PGPB，and pot experiment was designed to evaluate the effect of isolated PGPB on the growth of local grass. The results were as follows：（1）In total，two cold-tolerant PGPB strains named TS22 and TS27 were obtained，which were identified as Brevibacterium sp. and Bacillus mycoides respectively by 16S rRNA gene sequence analysis. （2）Both two strains could produce IAA，SID and ACC-deaminase activity. Strain TS22 showed high ACC-deaminase activity （264.69 nmol·α-KB mg-1·h-1），TS27 displayed higher IAA[（7.52±3.85）mg·L-1] and SID （92%）production ability. （3）Under low temperature （10 ℃），these two isolated PGPB exerted different effects on the growth of Poa annua and Elymus sibericus. Inoculation of strain TS22 significantly improved the growth of Poa annua in plant height，root length，aboveground dry weight，underground dry weight，and showed greater plant growth-promoting activity than strain TS27. This study provides valuable strain resources and experimental basis for application of plant-microbe technique in vegetation restoration in Northern Tibetan Plateau.

Key words：plant growth-promoting bacteria，low-temperature environment，low-temperature-tolerant bacteria，plant growth-promoting properties，plant phytoremediation，grassland degradation

近年来，藏北高原地区由于过度放牧导致草地植被日益退化，已严重威胁当地生态生物多样性、环境健康质量、当地经济发展和人类生活质量水平。因此，加强草地植被保护和修复受到越来越多的关注（Wang et al.，2019）。通过添加化肥、堆肥、高分子材料和腐殖酸等方法，虽然可以有效提高植被修复效率，但因成本高难以实现大规模修复。

PGPB是一类可以直接或间接改善植物健康而促进植物生长的细菌（Bashan & Holguin，1998），可以通过固氮、产吲哚-3-乙酸（Indole-3-acetic acid，IAA）、铁载体（siderophore，SID），产ACC-脱氨酶活性（ACC-deaminase activity，ACC）和溶解不溶性磷酸盐等方式增加植物营养吸收，或者分泌抗生素等物质，保护植物免受病原菌入侵。目前，PGPB已被广泛应用于农业生产中，如从印度喜马拉雅山脉的苋菜（Amarantus sp.）根际分离出来的耐低温假单胞菌（Pseudomonas sp.），具有产IAA、SID以及溶解磷酸盐等植物促生（plant growth-promoting，PGP）属性，使小麦幼苗的发芽率、株高和根长分别提高了19.2%、30.0%和22.9%（Mishra et al.，2009）。此外，PGPB在生态环境修复领域还表现出很大的潜力，尤其在特殊极端环境的植被修复方面，如PGPB（Azospirillum）与仙人掌在墨西哥等地沙漠治理的作用效果得到前期研究的证实。接种Azospirillum的仙人掌种子可以在不加肥料的碎石中生长良好，而未接菌的植株则枯萎甚至死亡（Bashan & de-Bashan，2010a）。采用PGPB可以改善土壤侵蚀区的植物健康和生长性能，增强其对干旱和盐碱等胁迫的耐受性，有助于脆弱生境原位植被再生，而无需额外添加化学肥料，降低了生物修复的成本。然而，将PGPB应用于促进西藏高寒草原牧草生长、修复当地植被的研究尚未见有报道。

鉴于藏北高寒脆弱生境条件的特殊性和土著微生物的影响，外源添加PGPB作用效果会受到限制。本研究从采集的西藏土壤中分离、筛选土著耐低温PGPB，并在室内模拟藏北低温条件，以藏北高原广泛分布的两种本地禾本科牧草早熟禾（Poa annua）和老芒麦（Elymus sibericus）为试验植物，对分离菌株的植物促生效果进行评价。

1 材料与方法

1.1 土壤样品采集

土壤样品采集于西藏那曲地区申扎县（88°37′—88°38′ E 、30°55′—30°56′ N），土壤类型以高寒草原土为主。采用5点混合取样方法，取样深度0～10 cm，重复3次。清除采集的土壤样品中的砾石和植物残渣后，将土壤样本放入消毒密封的聚乙烯袋中，带回试验室，每份土壤样品称取50 g，送样南京卡文思检测技术有限公司（Convinced-Test）进行土壤理化性质检测分析。其余土壤储存在-20 ℃冰箱中以便后续进行细菌分离。土壤样品的营养成分如表1所示。

1.2 耐低温菌的分离鉴定

将0.1 g土样放入装有1 mL磷酸盐缓冲液的离心管中，250 r·min-1、25 ℃振荡30 min后，对悬浮液进行梯度稀释。取100 μL稀释后的悬浮液于Luria-Bertani（LB）平板培养基涂布，置于低温环境（4 ℃）下培养，进行耐低温菌分离 （Reasoner & Geldreich，1985）。培养7 d后，挑取单克隆，转移到新鲜LB琼脂培养基上进行纯化验证。收集分离纯化后的菌株，提取总DNA，用细菌通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-ACGGTACCTTGTACGACTT-3′）进行16S rRNA基因序列PCR扩增，所得PCR扩增产物经验证后送上海生工公司测序。将测序所得序列与EzBiocloud数据库中的序列进行比对。利用MEGA 6.06中的邻位连接法，构建系统发育树。

1.3 PGPB植物促生属性分析

对分离菌株的促生特性进行了评价。根据Glickmann & Dessaux （1995）描述的方法，对分离菌株的产IAA能力进行检测。将菌株接种在含L-色氨酸的R2A培养基中，孵育72 h后，离心收集无菌上清液，用比色微板法测定培养基上清液中IAA在OD530  nm波长处的吸光值，并绘制IAA的标准曲线以定量分析。

按照Penrose & Glick （2002）提出的方法进行ACC脱氨酶活性的定量测定。将细菌菌体在不含硫酸铵的DF培养基中培养8 h，离心收集沉积的细菌细胞;將收集的细胞重新悬浮在添加3.0 mmol·L-1 ACC的DF培养基中，孵育24 h后，用比色法测定酶活性。

根据Cherif-Silini et al. （2016）描述的方法定量测定SID的产量。在KingB培养基中培养72 h后，离心收集500 μL上清液，与500 μL铬天青S测定混合溶液。在630 nm波长处测定混合物的吸光值。SID的百分比按以下公式计算：ST-SeST×100%。式中，ST是深蓝的CAS溶液的吸光值（对照），Se是从蓝色变为橙色的样品的溶液吸光值。

为检测菌株溶解不溶性磷酸盐的能力，将分离菌菌悬液分别点接于含有不溶性磷酸盐Ca3（PO4）2的Pikovskay琼脂平板的中心，置于28 ℃培养箱（冯瑞章等，2005）。通过观察菌落周围有无透明圈和测量透明圈的大小，来分析分离菌的溶解不溶性磷酸盐的能力，并判断它的有无及强弱。上述所有指标的测定均设置3个重复。

1.4 盆栽试验

首先，用75%乙醇溶液浸泡1 min和5% NaClO溶液浸泡5 min对早熟禾和老芒麦的种子进行表面灭菌处理，经灭菌水清洗3次后，灭菌种子分别用10 mL浓度为108 cfu·mL-1的菌悬液浸泡2 h，对照处理用灭菌磷酸盐缓冲液。然后，将种子播种在装有180 g灭菌砂的培养瓶中，加入54 mL的0.5倍改良霍格兰溶液，并在温室（25 ℃）中培养。根据西藏土壤矿物盐组成（表1）改良了Hoagland营养液，配方如下：94.5 g·L-1 Ca（NO3）2·4H2O，50.6 g·L-1 KNO3，8 g·L-1 NH4NO3，0.002 76 g·L-1 KH2PO4，49.3 g·L-1 MgSO4·7H2O，3.73 g·L-1EDTA-2Na，2.78 g·L-1FeSO4·7H2O，0.83 mg·L-1 KI，22.3 mg·L-1 MnSO4，0.25 mg·L-1Na2MoO4，0.025 mg·L-1CoCl2，6.2 mg·L-1 HBO3，8.6 mg·L-1ZnSO4和 0.025 mg·L-1 CuSO4（pH 6.0）。最后，种子萌发后，将幼苗移至低温（10 ℃）、光照强度为10 000 lx（光暗=14 h/10 h）的条件下培养（本试验采用的栽培条件是依据青藏高原6月份的平均温度、日照强度和日照时数而确定）。每个处理设置5个重复。

培养30 d后，收获植株。测量植株的株高、根长、地上鲜重、地下鲜重、地上干重和地下干重。

1.5 数据分析

采用IBM SPSS Statistics 20统计软件进行统计分析，对记录的数据进行单因素方差分析和双因素方差分析，以P值的大小评价其显著性。所有图示均由Origin软件（2018版）绘制。

2 结果与分析

2.1 耐低温细菌的分离鉴定

从西藏土壤中，最终成功分离得到TS22和TS27两株细菌。将所测得的分离菌株的16S rRNA基因序列与EzBiocloud数据库中的序列进行比对，确定菌株的分类学地位，构建系统发育进化树（图1），菌株TS22与Brevibacterium frigoritolerans DSM 8801具有最高相似性，为96%，因此初步鉴定其为Brevibacterium属的新种。菌株TS27与Bacillus mycoides DSM 2048具有最高相似性，为99%，因此该菌株分类为B. mycoides。菌株TS22、TS27的16S rRNA基因序列均已提交GenBank，获得登录号分别为MN710445、MN710449。

2.2 分离菌株植物促生属性检测

对这两株细菌的植物促生属性进行了检测，包括产IAA、溶解不溶性磷酸盐、产SID和ACC脱氨酶活性（表2）。表2结果显示，菌株TS22具有极高的ACC脱氨酶活性（264.69 nmol·α-KB mg-1·h-1），是菌株TS27的10倍。TS22、TS27均不具有溶磷能力，同时产IAA能力较低，分别为（3±0.31）、（7.52 ± 3.85）mg·L-1。菌株TS22、TS27具有较高的产SID能力，分别为89.58%±0.08%、92.74%±0.24%。

2.3 分离菌株对本地牧草生长的影响

如图2、图3所示，接种菌株TS22和TS27对当地牧草早熟禾和老芒麦的生长影响各不相同。如图2所示，与不接种的对照组相比，接种TS22显著提高了一年生早熟禾的株高、根长、地上和地

下部分干重。接种TS27的早熟禾株高、 根长、 地上和地下部分干重与不接种对照组相比，分别增加了20.7%、11.1%、89.4%和74.2%，但在统计学上不具有显著差异。

如图3所示，接种TS22和TS27没有明显的促进作用，甚至有轻微抑制作用。接种TS22使老芒麦地上和地下干重分别降低了1.4%和5.4%。而接种TS27的处理显著缩短了22%的根长。

2.4 分离菌株与植物生长属性的相关性分析

双因素方差分析结果表明，植物种类仅对地下鲜重、干重有显著影响，細菌种类对所有植物生长指标都有影响;植物和细菌交互协同作用，对植物生物量相关的指标有影响（表3）。

3 讨论与结论

在利用PGPB进行退化土壤植被再生修复的过程中，微生物菌剂的选择具有决定性作用。对于条件苛刻的特殊生境，接种外源PGPB菌剂到特殊生境会受到来自生存环境巨大变化和本土微生物竞争的双重挑战，从而限制了外源PGPB接种剂的存活及功能活性。选择土著PGPB作为接种剂，可以更好适应本土环境，有助于发挥预期效果（Schlaeppi et al.，2016）。

本研究针对藏北地区独特的地理环境和寒冷干燥的气候特征，从藏北土壤中分离到两株耐低温植物促生菌，Brevibacterium sp. TS22和Bacillus mycoides TS27。许多Bacillus属的细菌被发现具有植物促生功能（Santoyo et al.，2012），但关于Brevibacterium属菌的植物促生功能鲜有报道。Wang et al. （2016）从青藏高原细叶嵩草中分离筛选到Brevibacterium属的内生菌，该菌被检测发现具有多种植物促生特性，但该报道尚未对该分离菌进行进一步功能验证。 Meena et al. （2017）从库拉索芦荟根际中成功分离到一株具有多种植物促生属性的Brevibacterium frigoritolerans SMA23，在10 ℃低温下对小麦生长有积极影响。通过对分离菌产IAA、SID、ACC-脱氨酶等植物促生性能的检测发现，两株分离菌株均可以产IAA、SID和ACC-脱氨酶，并且TS22具有高效ACC-脱氨酶活性（264.69 nmol·α-KB mg-1·h-1），TS27具有更高的产IAA[（7.52±3.85）mg·L-1]和SID（92%）能力。 IAA是一种常见的植物促生长激素，Gonita-Mishra et al. （2017）报道了38株分离菌，其中89.47%的菌株能产生显著的IAA（4.7～77.41 mg·L-1）。作为一种高效的植物生长激素，较高的IAA产量能够引起幼苗的形态和生理变化（Masciarelli et al.，2013）。SID在植物根系铁的生物有效性中起着重要作用（Sorty & Shaikh，2015）。其与植物根际的铁具有很高的亲和力，能结合根际环境中大部分的有效铁，与此同时限制了根部病原微生物对有效铁的利用，起到了抑制病原菌增殖的效果（O′Gara，1992）。细菌产ACC-脱氨酶降低植物乙烯水平，缓解各类胁迫，是这些细菌发挥作用的关键组成成分，包括保护植物免受洪水、干旱、盐分、花卉枯萎、金属、有机污染物以及细菌和真菌病原体的侵袭（Glick，2014）。本研究中分离到耐低温菌株TS22和TS27不但能适应青藏高原寒冷高海拔环境，且具有不同程度的植物促生潜力，为后续藏北高原植被再生提供了宝贵的菌种资源。

当把TS22和TS27接种到藏北本地牧草早熟禾和老芒麦植物根际时，菌株TS22对早熟禾植株表现出明显的生长促进作用，而对老芒麦的生长没有明显促进效应;菌株TS27则对两种禾草的促生作用均不明显。已有研究表明，并非所有具有PGP特性的细菌都能对植物的生长产生积极影响，菌-植互作的环境与寄主植物及菌剂的种类均会影响植物促生的效果（de-Bashan et al.，2012）。同时，PGPB促进植物生长是一个复杂的过程，涉及不同促生属性间的协同作用。Bashan & de-Bashan（2010b）通过对兼有多种植物促生特性的PGPB菌株Azospirillum brasilense的作用机制研究发现，A. brasilense的作用机制并非单一，在一定环境条件下这些促生机制同时或相继运行。本研究的盆栽结果表明植物生长效果因植物和细菌种类的不同而有差异。菌株TS22所表现的多种促生属性间的协同模式可能更适合早熟禾植株的生长。由此可见，对于不同植株选择恰当的PGPB很重要，应根据接种试验效果进行有目的筛选，有关PGPB-宿主植物相互作用的机制研究有待于进一步挖掘。

综上所述，本研究在藏北高原特殊环境条件下分离筛选到可以有效促进当地牧草生长的低温植物促生菌，为后续植物-微生物技术在藏北高寒地区的植被修复应用提供了宝贵的菌种资源和应用基础。

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（責任编辑 蒋巧媛）