王 星，柴文栋，杨 俊，张小芳,姬广海

(1.河南省舞钢市质量技术检验测试中心，河南 舞钢 462500；2.河南省舞钢市枣林镇中心小学,河南 舞钢 462500;3.云南农业大学 植物保护学院，云南 昆明 650000)

1 引言

水稻是我国重要的粮食作物，我国水稻栽培面积占世界水稻栽培总面积的20%。造成水稻大量减产的细菌性第一病害水稻白叶枯病是由Xanthomonasoryzaepv.oryzae(Xoo)引起的。带菌种子传播是该病害传播的主要途径之一，在种子市场监管中由于缺乏高效的检测方法，往往造成带菌种子在市场中流通，给市场监管工作带来不必要的麻烦，目前常用的水稻白叶枯病菌检测方法主要根据病害特征识别和实时荧光PCR方法，但是这些方法效率低且成本贵的不足之处，因此，建立一个高效、准确的带菌种子的检测方法十分必要。

LAMP(Loop-mediated isothermal amplification)又被称为“环介导等温扩增反应”，国外相关学者发明的一种新型、快速、简便的核酸扩增方法[1]。LAMP具有操作简便，成本低、易识别、灵敏度高等优点，此外该技术还可用于体外难培养甚至无法培养的病原菌的检测，例如病毒的检测。目前，LAMP检测技术已被国内外众多学者成功用于各类病原菌的检测[2～4]。该方法具有简单、快速和灵敏的特点。因此，相对落后的普通PCR技术有望被LAMP技术在菌物检测中替代。

本研究建立了一种利用可视化环介导等温核酸扩增技术(LAMP)检测水稻白叶枯病原菌Xoo的方法。采用SYBR Green l染料法对扩增产物闭管检测，可视化快速得到结果，通过该研究以期基层市场监管中监测水稻白叶枯病菌提供新的技术手段。

2 材料与方法

2.1 供试材料

(1)供试菌株。供试的水稻白叶枯病菌(X.aryzaepv.oryzae)菌株由本实验室从云南省各个水稻白叶枯病发病区分离所得；供试的对照菌株包括水稻细菌性条斑病菌(X.oryzaepv.oryzicola)、甘兰黑腐病菌(X.campestrispv.campestris)、柑桔溃疡病菌(X.axonopodispv.citri)、常春藤叶斑病菌(X.campestrispv.hedera)、番茄斑点病菌(X.campestrispv.Vesicatoria)、丁香假单胞菌(Pseudomonassyringaepv.syringae)、香蕉细菌性枯萎菌(Burkholderiasolancearum)，保存于云南农业大学生物多样性国家工程。

(2)水稻样品。水稻植株感病样品分采自云南省德宏傣族景颇族自治州瑞丽市、芒市和景洪市水稻白叶枯病发病田块；水稻种子样品由云南省德宏傣族景颇族自治州农业局提供，稻种分为杂交稻和常规稻，均为当地主栽品种。

(3)试剂及仪器。Bst DNA polymerase large fragment(M0275S)，dNTPs，SYBR Green I购于北京百泰克生物有限公司，NA固体培养基，LB液体培养基，H886S12型恒温水浴锅，移液器，漩涡振荡仪，EasyPure Plant Genomic DNA Kit(全式金)，UJ200 0.2 mL Hi-Tube Dome Cap。

2.2 试验方法

2.2.1 细菌基因组DNA的提取

(1)细菌DNA的提取。参考于源华[5]的简便高效提取细菌总DNA的方法。用接种分别挑取各供试菌株于NA平板划线，置28 ℃培养箱过夜培养，然后挑取单菌落接种于15mL的LB液体培养基，置28 ℃，160 r/min摇床过夜振荡培养。取1～3 mL菌液，12000 r/min，5 min，离心收集菌体，弃上清；加入 200 μL dd H2O，吹打重悬。加入 200 uL 酚/氯仿(1∶1)，涡旋混匀。13000 r/min，2 min，取上清，重复步骤一次；取上清，加入2倍体积无水乙醇和1/10体积5 M NaCl，混匀。13000 r/min，5 min，弃上清，保留沉淀。该沉淀即为细菌总 DNA 样品；500 μL 75% 乙醇洗涤一次。室温敞口放置 5 min 晾干，加入 20 μL dd H2O溶解沉淀。用核酸蛋白仪测量所提样品DNA的纯度及核酸浓度，-20 ℃保存。

(2)水稻稻种总DNA的提取。根据全式金植物基因组总DNA提取试剂盒(EE111-01)说明书进行供试水稻稻种样品总DNA的提取。测量所提样品DNA的纯度及核酸浓度，加灭菌超纯水或TE(pH 8.0)溶解后-20 ℃保存。

2.2.2 LAMP引物设计

本研究针对水稻白叶枯病菌假定蛋白的特异保守区域设计引物，水稻白叶枯病菌的LAMP引物序列源于水稻白叶枯病菌标准菌株PXO99的DNA序列(GenBank 登录号：PRJNA28127)。用Bioedit软件进行序列分析，使用Primer Explore V 4.0在线软件自动生成的引物，根据引物设计原则使用PrimeSelect软件检查引物的二级结构，筛选出特异性高的LAMP引物(表1)。由昆明硕擎生物科技有限公司合成引物，用ddH2O溶解后分装，-20 ℃冰箱保存备用。

表1 水稻白叶枯病菌LAMP检测引物序列

2.2.3 LAMP反应体系的建立

LAMP检测反应体系为25 μL含:10 x Thermopol Buffer 2.5 μL, dNTP(2.5 mmol/L)4.0 μL,FIP(10 μmol/L)和BIP(40 μmol/L)各1.0 μL, LF(10 μmol/L)和LB(10 μmol/L)各0.5 μL, F3(40 μmol/L)和B3(10 μmol/L)各2.0 μL, MgSO4(100 mmol/L)1.0 μL,Bst DNA polymerase 4U, DNA模板或菌悬液2 μL，加ddH2O补足至25 μL。将反应混匀并离心，阴性对照不加模板。在LAMP反应开始前，向反应管内盖子上加入10 X SYBR Green I 荧光染料1 μL。将各反应管插入在漂浮板上，并依次置于65 ℃恒温加热1 h，80 ℃加热5 min使酶失活终止反应，瞬时离心并观察反应的溶液颜色，阳性反应荧光绿色，阴性反应则为橙色，试验进行3次。

2.2.4 LAMP特异性检测

以水稻白叶枯病菌的近缘细菌及其他种细菌(对照菌见供试菌种1.1)为对照菌检测LAMP方法的特异性。采用1.2.3己建立的反应体系进行LAMP检测，通过荧光染料法检测结果。

以水稻白叶枯病菌的近缘细菌为对照菌检测LAMP方法的特异性。对照菌包括水稻条斑病菌、甘兰黑腐病菌、柑桔溃疡病菌、黄单胞菌常春藤叶斑病菌。按照百泰克细菌基因组DNA提取试剂盒说明书，分别提取供试菌株的基因组DNA，进行LAMP扩增，测定LAMP反应的特异性。利用己建立的反应体系进行LAMP检测，反应结束后通过荧光染料法以及琼脂糖凝胶电泳分析检测结果。

2.2.5 LAMP灵敏度检测

以水稻白叶枯病菌总DNA和菌悬液为模板进行灵敏度分析。通过梯度稀释使DNA浓度依次为100 ng/uL、10 ng/uL、1 ng/uL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL、1 fg/μL；将在NA培养基上培养24 h后的白叶枯病菌配置成菌悬液，利用分光光度计测定浓度OD600nm=0.3(约3×108cfu/mL)，通过梯度稀释使得浓度依次为3×108cfu/mL、3×107cfu/mL、3×106cfu/mL、3×105cfu/mL、3×104cfu/mL、3×103cfu/mL、3×102cfu/mL、3×101cfu/mL。采用2.2.3己建立的反应体系进行LAMP检测，通过荧光染料法检测结果。

2.2.6 样品检测

市售稻种(楚粳28号)、两优2161以及采集的疑似感病种子取5粒(约0.1 g)，放入1.5 mL的离心管中，在无菌微型管中研磨粉末状，加入500 μL无菌水水浸泡30 min。感病的水稻叶片按照植物DNA提取试剂盒(北京百泰克生物有限公司)进行提取。采用2.2.2己建立的反应体系进行LAMP检测，通过荧光染料法检测结果。

3 结果

3.1 特异性检测的结果

分别以水稻白叶枯病菌的总DNA及近源细菌DNA为模板，用已经建立的反应体系进行LAMP特异性检测。结果显示:以水稻白叶枯总DNA为模板的反应管反应液颜色变为荧光绿色，其他7个对照菌株和空白对照则仍为橙色(图1)。水稻白叶枯病菌病菌LAMP灵敏度检测结果表明LAMP引物设计完全可以区分水稻水稻白叶枯病菌和其他近源菌种，具有特异性。

注：1.水稻白叶枯病菌2.水稻细菌性条斑病菌3.甘兰黑腐病菌4.柑桔溃疡病菌5.常春藤叶斑病菌6.番茄斑点病菌7.丁香假单胞菌8.香蕉细菌性枯萎菌9.空白对照

3.2 灵敏度检测的结果

分别以不同浓度的白叶枯总DNA和水稻白叶枯菌菌悬液为模板，用已经建立的LAMP体系进行灵敏度分析。结果如下：当水稻白叶枯病菌总DNA浓度为100 ng/μL、50 ng/μL、10 ng/μL、1 ng/μL、100 pg/μL、50 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL均可观察到颜色变化(图2)；当水稻白叶枯病菌的悬浮液浓度为3×108cfu/mL、3×107cfu/mL、3×106cfu/mL、3×105cfu/mL、3×104cfu/mL、3×103cfu/mL时，均可观察到颜色变化(图3)。水稻白叶枯病菌LAMP灵敏度检测结果表明LAMP方法对菌株DNA检测最低值为100 fg/μL，菌悬液检测最低值为3×103cfu/mL。

注：1.100 ng/uL；2.10 ng/uL；3.1 ng/uL；4.100 pg/uL；5.10 pg/uL；6.1 pg/uL；7.100 fg/uL；8.10 fg/uL；9.1 fg/uL；10.空白对照

注：1.3×108 cfu/mL；2.3×107 cfu/mL；3.3×106 cfu/mL；4.3×105 cfu/mL；5.3×104 cfu/mL；6.3×103 cfu/mL；7.3×102 cfu/mL;8.3×101 cfu/mL；9.空白对照

3.3 稻种、稻株样品检查结果

以采集的疑似感病水稻样品及市售稻种的植物总DNA为模板，用已经建立的检测体系进行检测。SYBR Green I荧光染料法检测结果见图4，具体分析结果见表2，LAMP检测结果若为橙色，表明均未携带水稻白叶枯病菌；LAMP检测结果为荧光绿色，表明携带水稻白叶枯病菌。由检测结果可知：从三个地区采集的疑似水稻白叶枯病感病叶片均携带病原菌，由德宏州农业局提供的稻种样品中，有三个携带有水稻白叶枯病原菌。

表2 水稻样品进行LAMP检测结果

注：荧光绿色表示阳性结果；橙色表示阴性结果

4 结论与讨论

本研究以水稻白叶枯病菌为研究对象，利用 Primer Explorer V4.0设计软件，设计了4条普通LAMP引物和2条特异LAMP环引物，反应只需在65 ℃恒温下反应1 h，利用SYBR Green I作为荧光指示剂，水稻白叶枯病菌呈荧光绿色的阳性反应，对照菌株则保持不变。LAMP完全可以对水稻白叶枯病菌和其近源菌种进行检测，反应检测灵敏度DNA为100 fg/μL，菌悬液为3×103cfu/mL。

目前在生产上水稻白叶枯病害往往造成严重危害[6]，但没有有效的防治办法，而种子是重要的传染源之一，因此在市场监管过程中及早检测带菌种子，对预防该病害具有重要意义。在病原细菌的分子诊断中, 16S rRNA基因(16S rDNA)、23S rRNA基因(23S rDNA)、16S～23S rRNA间区、IS1113扦入序列等常被选用的靶基因。然而，研究表明这两个基因是相同的，用这些基因不能检测鉴定这两个密切相关的变种[7]。

国内外鲜见水稻白叶枯病原菌的环介导恒温扩增方法报道。目前国内仅仅有湛彦超[8]报道利用水稻白叶枯病原菌基因组DNA特有的保守区域设计LAMP引物，通过优化反应体系，检测系统的水稻白叶枯病。本研究与前者研究相比，本研究有三个改进之处。其一，引物设计选取的靶标序列不同。前者研究中应用GENBANK网站上的BLAST软件进行比对，选取 5个匹配度均在98%的水稻白叶枯病原菌基因组，而本研究是根据水稻白叶枯病原菌的假定蛋白基因序列设计LAMP引物。其二，前者研究只设计出一对外引物和一对内引物。Nagamine等[9]研究发现，假如采用环引物(Loop primers)，反应时间就会减少一半以上，本研究筛选到了一对环引物，加快LAMP扩增的速率，缩短检测时间。其三，对LAMP扩增产物结果的判断方法不一样。前者试验过程中经过高温，因此往往会产生的气溶胶，从而容易导致污染，致使检测结果会出现假阳性。此外，琼脂糖凝胶电泳法由于电泳前向胶孔中点样后，所点样的扩增产物并不会完全沉降，因此会影响灵敏度的检测，同时用凝胶电泳方法对LAMP检测结果进行判断非常浪费时间，这是不能满足快速检测的要求。而本研究采用了不开盖判定结果，具有可视性、即时性的检测的优点，并且避免了开盖后可能会造成的气溶胶污染。相比之下，染料颜色的变化不仅可以提高肉眼的识别率，而且可以直接用于市场监管过程中的诊断，是最为简单方便的LAMP结果判定方式，因此检测的准确性和灵敏度更有保证。