叶婵娟

（扬州市食品药品检验检测中心，江苏225009）

黄体酮软胶囊属于孕激素类药物，可用于治疗由黄体酮缺乏引起的机能障碍、排卵功能障碍引发的月经失调、痛经及经前期综合征、出血、绝经前紊乱、绝经，也有助于妊娠［1-2］。黄体酮的含量测定方法已经成熟，但是由于剂型的影响，软胶囊剂在试验过程中的操作误差较其他制剂来说会更大。本文就HPLC法测定黄体酮软胶囊含量进行不确定度分析，以验证试验的准确性，保证测量结果可靠性。

对样品进行准确的表征是进行测量的目的，但是测量值与真值之间必然存在一定的差异，这种差异来源于测量误差，而测量误差不可避免地存在于试验的方方面面。由于误差存在的必然性，而检验机构出具报告的准确性又是一个机构的生命线，因此作为一个检验检测机构，测量的准确性评价就显得尤为重要。测量不确定度是“表征合理地赋予被测量值的分散性，与测量结果相关联的参数”，其可以在一定程度内对被测量客观值进行评定，对测量结果的质量及水平进行定量表征。在试验中测量不确定度越小，测量结果质量越高，其使用价值越大［3-4］。

本文参考《测量不确定度评定与表示》中相关规定，并根据《化学分析中不确定度的评估指南》，利用日常检验过程中HPLC法测定黄体酮软胶囊的含量数据进行不确定度分析，以期找出影响不确定度的各类因素，并对不确定度进行评估，为检验检测报告的合理评价提供可靠依据，也为HPLC法测定其他样品进行指导，降低不确定度，提高测量结果质量。

1 测定方法及不确定来源

1.1 仪器与试药 日本岛津LC-20AD高效液相色谱仪，SPD-10A紫外检测器，LC Solution化学工作站，瑞士Mettler公司XS205DU型电子分析天平；Milli-Q IQ7000超纯水机，KH-400KDB型高功率数控超声波清洗器。黄体酮对照品（中国药品生物制品检定研究院，批号100027-201810，供鉴别及含量测定用，105℃干燥3 h后使用，含量：99.6%）；黄体酮软胶囊（浙江爱生药业有限公司，批号20200303，规格：100 mg）；甲醇（北京迪马科技有限公司，色谱纯），水为纯化水（自制）。

1.2 试验方法与结果

1.2.1 色谱条件 色谱柱：Agilent 5 HC-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相；甲醇-乙腈-水（25∶35∶40）；检测波长：241 nm；柱温：30℃；流速：1.00 ml/min；进样量：20 μl。

1.2.2 对照品溶液的制备 取黄体酮对照品约10 mg，精密称定，置于50 ml量瓶中，加甲醇适量，振摇使黄体酮溶解，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

1.2.3 供试品溶液的制备 取本品20粒，精密称定，研细，精密称取适量（约相当于黄体酮50 mg），置于100 ml量瓶中，加甲醇适量，超声使黄体酮溶解，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液10 ml，置于25 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

1.2.4 含量测定结果 根据试验过程，含量计算公式可表示为式中：Q:黄体酮软胶囊标示百分含量（%）；Ay:供试品溶液的峰面积；Ad：对照品溶液的峰面积；Wd:对照品称样量（mg）；Wy:供试品称样量（g）；P:对照品的纯度；Vd：对照品的稀释体积（ml）；Vy1：供试品的一次稀释体积（ml）；Vy2：供试品二次稀释时移液管取样体积（ml）；Vy3：供试品的二次稀释体积（ml）；W:供试品的平均片重（g）；100：供试品的规格（mg）。计算结果：黄体酮软胶囊含量为标示量的95.30%。

1.3 不确定度分量来源的分析 从公式中看出HPLC法测定黄体酮软胶囊含量的测量不确定主要源于①对照品方面：对照品纯度、对照品称量、对照品稀释和对照品溶液色谱峰面积；②样品部分：样品平均片重、样品称量、样品稀释以及样品溶液色谱峰面积。天平的校准和称量的重复性是称量不确定度的主要来源；稀释的不确定度来源于玻璃仪器的校准及使用温度；峰面积的不确定度来源于高效液相色谱仪的重复性及仪器所处的环境和性能。

2 各分量的不确定度分析

2.1 对照品纯度引起的相对不确定度urel（P） 黄体酮对照品购自中国食品药品检定研究院，105℃干燥3 h后使用，纯度为99.6%，由于中检院尚未给出不确定度，现假定其分散区间的半宽度为α=0.25%，按B类不确定度，矩形分布计算，取包含因子则对照品纯度引入的不确定度为=1.45×10-3。

2.2 对照品称量引起的相对不确定度urel（Wd） 来源主要有两个：天平的示差和天平称量的重复性。天平示差的不确定度：根据电子天平检定证书：820022887-011，其示差误差为±0.05 mg，按B类不确定度，矩形分布分析，取包含因子其不确定度为天平称量重复性的不确定度：电子天平检定证书：820022887-011，其给出天平示值重复性标准偏差为0.1 mg，按B类不确定度，矩形分布分析，其不确定度为=5.77×10-2。则单次称量的标准不确定度为本法采用减重法进行称量，并进行2次称量，所以不确定度为两份对照品称样量分别为10.31 mg和10.44 mg，则对照品称量引入的标准不确定度为=1.24×10-2。

2.3 对照品稀释引起的相对不确定度urel（Vd） 对照品溶液制备过程中有稀释步骤，稀释过程中包含玻璃仪器的不确定度。玻璃仪器的不确定度主要包含两个方面；第一，量瓶体积校准的不确定度。根据JJG196-2006《常用玻璃量器检定规程》，A级50 ml量瓶的容量允差为±0.05 ml，按B类不确定度，矩形分布分析，取包含因子=5.77×10-4。第二，量瓶校准时的温度与试验时使用温度差异。试验时环境温度为18℃，按照JJG196-2006《常用玻璃量器检定规程》，水的体积膨胀系数为0.000 21 ml/℃，因此50 ml量瓶产生的体积变化为50×0.000 21×2=0.021 ml，按照矩形分布，属于B类不确定度，取包含因子，其标准不确定度为综上 对照品稀释引起的标准不确定度为=2.42×10-4。

2.4 对照品溶液色谱峰面积的相对不确定度urel（Ad）色谱峰面积不确定度的主要影响因素为峰面积重复性、仪器、环境、进样体积等。由于对照品溶液与供试品溶液在基本相同的条件下进样，仪器环境、进样体积等因素造成的不确定度可互相抵消，所以忽略仪器环境和进样的影响。故峰面积重复性是影响对照品溶液峰面积不确定度的主要因素。本次试验中，对照品1重复进样3次，峰面积分别为9 950 591、9 974 909和9 978 032，平均值为9 967 844，对照品峰面积的标准不确定度为相对不确定度为对照品2进行2次重复进样，峰面积各为9 895 362和9 926 831，平均值为9 911 097，对照品峰面积的标准不确定度为相对不确定度为对照品峰面积的相 对 不确定度为=2.70×10-3。

2.5 平均片重引起的相对不确定度urel（W） 精密称定供试品20粒，求得总重为5.034 2 g，平均片重为W=0.251 7 g/片，不确定度分析同“2.2”项下。由天平校准引起的不确定度为urel（W）1由天平称量重复性引起的不确定度为=1.99×10-5。故由样品平均片重引起的相对不确定度为。

2.6 供试品称量引起的相对不确定度urel（Wy）本次试验供试品共取2份：Wy1=0.167 1 g；Wy2=0.170 8 g，不确定度分析同“2.2”项下。由天平校准引起的不确定度为由天平称量重复性引起的不确定度为故供试品称量引起的相对不确定度为urel（Wy）

2.7 供试品稀释引起的相对不确定度urel（Vy） 不确定度分析同“2.3”项下。根据国家计量检定规程规定，A级100 ml量瓶的容量允差为±0.10 ml，A级25 ml量瓶的容量允差为±0.03 ml，A级10 ml移液管的容量允差为±0.020 ml，按B类不确定度，矩形分布分析，取包含因子，则100 ml量瓶引起的相对不确定度为=2.43×10-4；25 ml量瓶引起的相对不确定度为10 ml移液管引起的相对不确定度为urel（Vy）3由样品稀释引起的标准不确定度由以上3项合成得到

2.8 供试品溶液色谱峰面积的相对不确定度urel（Ay） 供试品溶液的色谱峰面积采用双样双平行进行测定，测定的结果用极差法计算，记录双样测量峰面积分别为：10368772、10342117及11219389、11 214 004，因 此，=10 355 445，Ry1=10 368 772-10 342 117=26 655；=11219389-11 214 004=5 385。取n=2时的极差系数C=1.13，则供试品溶液色谱峰面积的相对不确定度为=2.32×10-3。

3 计算合成相对标准不确定度

4 给出扩展不确定度

试验结果一般用扩展不确定度来表示，取包含因子k=2（置信概率约为95%），则含量测定扩展不确定度uc（Q）=2×uc（Q）=2×1.24%=2.48%。含量测定结果可表示为Q+U（Q）:95.3%±2.48%，k=2（95%的置信区间）。

5 讨论

对HPLC法测定黄体酮软胶囊的含量的不确定度分析，得到检测结果的扩展不确定度为2.48%（k=2）。由上述评估过程可知，在HPLC测量黄体酮软胶囊的含量中，对照品的称量是不确定度分析中对不确定度影响最大的一个分量，其次是色谱峰面积形成的影响。因此在日常试验中要做好质量控制，严格规范称量、稀释、进样等关键步骤。对于称量来说，试验中可采取增加称样量和选用更高精度的天平的方法来减少称量对不确定的影响，严格按照《中国药典》称量要求进行称量，控制实验室环境，保持适宜的温度和湿度，以减少环境对称量及其他试验步骤的影响；就色谱峰面积而言，可以考虑重复多次进样来减少其对不确定度的影响，定期做好仪器维护和期间核查保证仪器的正常性能。

试验中的人员、仪器、试剂、试验方法、环境等各个方面都会影响试验的准确性［4］。要把好试验过程中的每一关。做好人员培训，尽量减少试验操作上的误差；在日常中要做好仪器维护，确保仪器性能，定期做好玻璃器具的检定，保证试验使用的各种仪器器具都是在正常的状态；在采购验收时要注重产品质量，为试验打下坚实基础；试验时确认试验方法，保证按标检验；维护实验室环境为试验提供一个适宜的温湿度环境，并保持环境的稳定减少环境改变带来的影响。而且在试验过程中，尽量减少稀释步骤，如必须稀释可进行更大体积的稀释，以减少试验误差。通过这些方法可降低合成相对不确定度，提高检验质量。

测量不确定度作为评定测量结果可信度的依据，在评价分析方法、实验室评定、确定测试人员的技术水平及判定药品质量是否准确方面都具有重要意义［6-7］。评定不确定度时，应尽量将产生不确定度的所有来源都考虑周全，因为重要的不确定度分量几乎完全取决定合成不确定度的数值。由本文的研究也提示本文建立的测量不确定度评定方法，也可以为其他药品应用高效液相法进行含量测定的测量不确定度的评定提供参考，为液相方法测定含量提供技术上的支持，关注误差来源，减少误差的产生，提高测量数据准确性。