李瑞明，杨梦雅，3，孙彩虹，3，罗学军*

（1.天士力控股集团有限公司研究院现代中药开发中心，天津300410；2.天士力医药集团股份有限公司创新中药关键技术国家重点实验室，天津300410；3.中国药科大学中药学院，江苏210009）

三七叶系五加科人参属植物三七Panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen的干燥茎叶，其性温，味辛，主要用于止血、消肿、定痛，治吐血、衄血、便血、外伤出血、痈肿毒疮、跌打肿痛、偏头痛等症，主要产区为云南、广西［1-4］。近年研究表明三七的茎叶可供药用，且毒副作用小。三七叶的活性成分三七叶皂苷属达玛烷型三萜皂苷，其对血液系统、心血管系统、神经系统和代谢系统作用与三七根皂苷相似。由于人们的传统习惯多以根入药，对三七茎叶资源综合利用研究很少［5］。现已报道从三七茎叶中分离得到的皂苷成分有23种，三七茎叶含总皂苷约4%~6%，其中人参皂苷Rb3含量最高［6］。

1 仪器与试药

1.1 仪器Waters Aquity Arc-Qda HPLC（Water公司）；梅特勒XS205DU分析天平（梅特勒托利多公司）；U-3900紫外分光光度计（日立公司）。

1.2 试药18批三七叶，包括13批3年生（编号19-3-1~19-3-13，其中19代表2019年采收，3代表3年生，1~13为流水号）和5批2年生（19-2-1~19-2-5）于2019年11—12月采自云南和四川，另12批均为3年生（编号20-3-1~20-3-12）于2020年11—12月采自云南，均依据1990版广西省中药材标准三七叶项下性状及鉴别要求进行鉴别，均符合标准要求。人参皂苷Rb3（批号111686-201504，中国食品药品检定研究院）；甲醇、石油醚（30~60℃）、正丁醇、香草醛均为市售分析纯；乙腈为色谱纯（批号JA088630，Merck公司）。

2 人参皂苷Rb3含量测定的方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Agilent Zorbox SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）流动相：乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脱：0~19 min，30%→35%乙腈；19~21 min，35%→50%乙腈；21~26 min，50%乙腈；检测波长：203 nm；流速：1 ml/min；柱温：30℃；进样量：10 μl。理论板数按人参皂苷Rb3峰计算应不低于6 000。

2.2 三七叶样品的前处理 将2019年采集的13批3年生样品分别分解成叶部、茎部和基部（整株最下端2~3 cm），2019年5批2年生及2020年12批3年生样品保持全株，分别粉粹，过2号筛。

图1 3年生三七叶部位分解图

2.3 溶液的制备

2.3.1 对照品溶液的制备 取人参皂苷Rb3对照品适量，精密称定，加乙醇制成每1 ml含0.5 mg的溶液，即得。

2.3.2 供试品溶液的制备 取本品粗粉0.2 g，精密称定，置索氏提取器中，加甲醇40 ml，加热回流3 h，提取液挥干，加水10 ml使溶解，加石油醚（30~60℃）萃取3次，每次10 ml，弃去醚液，水层加水饱和正丁醇萃取3次，每次10 ml，收集正丁醇层，水层弃去。正丁醇液水浴蒸干，残渣加甲醇溶解并定量转移至10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 线性关系考查 分别吸取上述对照品溶液2、4、6、8、10和12 μl，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图。以人参皂苷Rb3进样量为横坐标，以峰面积数值为纵坐标，绘制人参皂苷Rb3的标准曲线。回归方程Y＝274.82 X+2.173 3（r=0.999 9）。即人参皂苷Rb3进样量范围为0.98~5.92 μg时，线性关系良好。

2.5 精密度试验 取上述对照品溶液10 μl重复连续进样6次，以峰面积计算，RSD为0.17%，表明仪器精密度良好。

2.6 重现性试验 取三七叶6份，精密称定，按供试品溶液制备方法制备，摇匀，滤过，取续滤液，分别测定，RSD为0.93%，结果表明该方法重现性良好。

2.7 稳定性试验 取方法重现性中第1份样品，在室温条件下分别于2、4、8、12和24 h时精密吸取10 μl注入高效液相色谱仪，记录色谱图，RSD为1.67%，表明样品溶液在24 h内稳定。

2.8 加样回收率 精密称取适量人参皂苷Rb3对照品，加甲醇制成每1 ml含0.551 mg的溶液，作为对照品储备液。精密称取三七叶样品约0.1 g，置索氏提取器中，精密加入对照品储备液5 ml和甲醇35 ml，依照供试品溶液制备方法制备，平行制备6份，测定，计算回收率。结果6份样品平均回收率为98.59%，RSD为1.85%。见表1。

表1 加样回收率试验结果（n=6）

2.9样品测定 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μl，注入液相色谱仪，测定，结果见表2。不同生长年限比较：3年生的整株样品平均含量为1.89%（除19-3-13批外），2年生的整株样品平均含量为1.38%。不同部位的比较：叶部、茎部和基部中人参皂苷Rb3平均含量分别为2.19%、0.07%和0.05%；把叶、茎和基部加和作为一个整体，并按照叶、茎和基部占整体的质量占比，计算可得叶部中占98.20%，茎部中占1.58%，基部中只占0.23%。不同采收年份的比较：2019年采集的12批和2020年采集的12批3年生三七叶整株中人参皂苷Rb3平均含量为1.41%和2.41%。

表2 不同样品中人参皂苷Rb3含量测定结果

3 总皂苷含量检测方法与结果

3.1 方法 照紫外可见分光光度法测定（《中国药典》2015版四部通则0401）。

3.2 供试品及对照品溶液的制备 取“2.3.1”项下对照品溶液，用甲醇稀释成0.05、0.1、0.15、0.2和0.25 mg/ml，作为对照品溶液。取“2.3.2”项下各供试品溶液1 ml，加甲醇稀释至10 ml，作为供试品溶液。

3.3 测定法 精密量取对照品溶液及供试品溶液各1 ml，置10 ml具塞试管中，水浴蒸干，精密加入新配制的5%的香草醛冰醋酸-高氯酸（1∶4）的混合溶液1 ml，摇匀，密塞，置60℃水浴中加热10 min，取出，流水冷却，精密加入冰醋酸5 ml，摇匀，以试剂作空白。照紫外可见分光光度法，在550 nm的波长处测定吸收度，即得。

3.4 线性关系考查 分别检测浓度为0.05、0.1、0.15、0.2和0.25 mg/ml的对照品溶液并绘制标准曲线，得标准曲线为Y=2.307 X+0.215 3（r=0.995 3），线性关系良好，其浓度范围为0.05~0.25 mg/ml。

3.5 总皂苷含量测定 对19-3-4、19-3-6、19-3-8 3批3年生，19-2-1、19-2-4、19-2-5 3批2年生，及19-3-13（霜冻3年生三七叶）进行了总皂苷检测。结果显示：3年生的整株总皂苷含量平均值为5.70%，叶、茎和基部分别为10.61%、1.06%和0.70%，2年生整株的平均含量为5.30%。经过霜冻过后的三七叶叶部的总皂苷含量低于正常水平。按照叶、茎和基部占整体的质量占比，计算得到总皂苷在叶部占94.96%，茎部占3.20%，基部只占0.65%，分布与人参皂苷Rb3类似。见表3。

表3 不同样品中总皂苷含量测定结果

4 讨论

4.1 由以上结果可知，人参皂苷Rb3及总皂苷均主要分布在叶部，占比95%~99%，茎和基部中仅占1%~5%，因此在生产中可以通过控制茎叶比例来控制三七叶的质量。

4.2 人参皂苷Rb3含量测定方法是针对三七叶整株开发的方法，由于茎部和基部中人参皂苷Rb3含量极低，已超出线性范围，虽然其含量存在一定偏差，但是不影响本文的研究结论。

4.3 本研究表明霜冻天气对三七叶人参皂苷Rb3和皂苷含量有重大影响，如19-3-1批中人参皂苷Rb3含量为2.42%，霜冻后采样中仅为0.66%，因此遭受霜冻后的三七叶不建议采收。据文献［7］报道：人参茎叶因霜冻导致细胞壁破裂，细胞内的糖苷酶得以释放，将人参皂苷分解。三七叶的人参皂苷Rb3含量在霜冻后减少的机制可能与人参茎叶一致。

4.4 2019 年和2020年采收的样品中人参皂苷Rb3含量相差1%，目前尚没有合理的解释，依据“4.3”项下结论推断可能与生长及采收期间气候变化有关，建议继续采集1~2年的样品进行跟进研究。