王大鹏，孔丽娜，黄 姗，闫金国

（潍坊护理职业学院医学基础部，山东 青州 262500）

近年来的研究成果深化了我们对于木葡聚糖生物合成、重排及降解的酶学认识。研究发现木葡聚糖内糖基转移酶/水解酶（xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase, XTH）为多基因家族编码的一类蛋白质，属于糖苷水解酶家族GH16。其对植物根茎叶的形态建成、木质部的形成中发挥重要作用，并能影响植株果实发育，增强植株抗逆性。

人工改造过的Cas9/gRNA 系统通过gRNA 引导Cas9 蛋白识别并剪切带有gRNA 靶点的双链DNA，用于基因敲除和精确编辑DNA 等操作。CRISPR 技术进行基因敲除和编辑操作的第一步，需要获得剪切活性高的gRNA 靶点。Cas9/gRNA 剪切活性是由gRNA 靶点的识别序列决定的，每个gRNA 的剪切活性都会不同。本研究经体外gRNA 活性检测，选取高效靶点，成功构建拟南芥XTH33 基因敲除质粒，并将敲除质粒转入农杆菌GV3101，为进一步进行XTH33 基因功能鉴定奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

gRNA 靶点效率检测试剂和pUbi-atU6-gRNA 质粒骨架均由北京唯尚立德生物科技有限公司购买，DH5α 感受态细胞、Loading Buffer、DNAmarker、T4 磷酸化酶（T4PNK）、质粒纯化试剂盒、PBS 缓冲液、成品LB 培养基粉末、琼脂糖粉、农杆菌GV3101、T4连接酶、引物合成及测序由博迈德生物科技有限公司完成。

1.2 XTH33 基因的gRNA 设计与合成

首先应用在线工具（http：//crispr.mit.edu）设计出符合实验要求的gRNA，gRNA 设计的主要原则[2]：必须选择在靠前的外显子区域；3’端要20 个连续的碱基序列，有NGG 碱基序列但不包括PAM 序列；并用生物信息学软件对拟南芥进行全基因组比对，尽量降低脱靶风险，以防Cas9 无法工作，需避免染色体和核小体三维结构造成的空间位阻效应，设计完成后合成引物gRNA-G1-FP1、gRNA-G2-FP2、gRNA-G3-FP3、gRNA-RP。

1.3 体外gRNA 靶点活性检测

四 条 引 物gRNA-G1-FPg1、gRNA-G2-FPg2、gRNA-G3-FPg3、gRNA-RP，分别使用T7-gRNA-FPg（1-3）和gRNA-RP 引物对，以标准gRNA 模板为模板做PCR，对于每个样品50μL 体系扩增2 管，检测正确后使用PCR 产物纯化试剂盒进行过柱纯化操作，最后使用40μ LDEPC H2O 洗脱DNA，测浓度（至少要≥70ng/μL）作为后续体外转录的DNA 模板。同时准备标准gRNA1（g1）和标准gRNA2（g2）的PCR 产物。酶切DNA 的准备：将gRNA 靶点（包括PAM 序列）通过搭桥PCR 的方式构建到PCR 产物中，回收备用。gRNA 的转录：10×Transcription Buffer 2μL、rNTPT7 2μL、RNA Polymerase Mix 2μL、gRNA PCR 产物（上一步产物）1μg、DEPC H2O up to 20μL，以上混合后，37℃反应2H，反应结束后，加入2μL DNase I，37℃反应30min，并对gRNA 进行回 收 与 提 取。Cas9/gRNA 体 外 酶 切：spCas9 1μL、10XspCas9 buffer 2μL、gRNA（体外转录）50ng、酶切的dsDNA 50ng、ddH2O up to 20μL，充分混合后，37℃反应30min，加入3μL DNA Loading Buffer 混合后65℃煮5min，跑2%琼脂糖凝胶电泳检测，对比与两个对照gRNA 估算活性。

1.4 pUbi-atU6-gRNA-XTH33 质粒的构建及鉴定

反应体系：XTH-G3-Sense 5μL、XTH-G3-Anti 5μL、ddH2O 15μL 混匀后，95℃3min，95℃到25℃缓慢冷却，并16℃5min。第一步 的 产 物1μL、Cas9/gRNAVector 1μL、Solution 1μL、Solution2 1μL、H2O 6μL 混匀后16℃反应2h。取第二步产物5～10μL 加入到刚解冻的50μLDH5a 感受态细胞中，混匀，冰浴30min 后，42℃热激90s，冰上静置2min，然后加入500μL 无抗LB，置于37℃恒温摇床中，170 转，复苏1h 后涂卡纳抗性的平板，培养过夜，挑取单菌落摇菌，并提取质粒，直接进行基因测序鉴定。鉴定正确的质粒与农杆菌GV3101 感受态一管，混合后冰浴10min。然后置于液氮中8min，随后37℃水浴5min。从水浴锅中取出后冰浴2～3min，加入800μl 无抗生素的YEB 液体培养基，28℃180rpm 摇床上培养4h 左右，取出500μl 菌液，均匀地涂布于加50mg/L Kan和50mg/L Rif 的YEB 琼脂培养基上，28℃培养出单菌落，并进行PCR 鉴定。

2 结果

2.1 体外gRNA 靶点活性检测

体外gRNA 靶点活性检测结果见图1，凝胶电泳结果显示G3 靶点活性明显大于标准品一的酶切效率，在50%以上，表明G3 靶点活性良好，可以使用。

图1 体外gRNA 活性检测结果

2.2 pUbi-atU6-gRNA-XTH33 质粒构建结果

挑取2 个白色菌落摇菌，提质粒进行测序鉴定，测序比对结果见图2。结果显示靶点序列全部插入正确，XTH33 敲除质粒pUbi-atU6-gRNA-XTH33 构建成功。

图2 质粒测序比对结果

2.3 pUbi-atU6-gRNA-XTH33 质粒转入农杆菌

质粒转入农杆菌感受态GV3101 后，28℃培养24h，出单菌落，挑取6 个单菌落，用引物XTH-G3-Sense：TTGGTCGAGAGTGAGCTTAGCGAGGG，pUbi-atU6-RP：GATGAAGTGGACGGAAG GAAGGAG 进行PCR 鉴定。结果显示1、2 号菌落批出430bp 的目的条带，鉴定正确。成功将pUbi-atU6-gRNA-XTH33 质粒转入农杆菌GV3101，鉴定结果见图3。

图3 农杆菌菌液PCR 鉴定结果

3 讨论

CRISPR 系统是由Cas 基因和成簇间隔的短回文重复序列组成。其原理是gRNA 序列可以靶向识别可以碱基互补的DNA 序列，并在Cas9 蛋白作用下特异性地切割其靶序列[2]。与传统的siRNA 和shRNA 基因沉默技术相比，CRISPR/Cas9 技术直接在基因水平进行操作，改变基因组成，使基因沉默效果更加彻底，而且CRISPR/Cas9 敲除质粒构建更为简单和高效，对于同物种不同基因，只需要设计不同基因的gRNA 序列，并插入载体骨架即可，但Cas9/gRNA 剪切活性与gRNA 靶点的识别序列有关，gRNA 的活性高低直接影响基因剪切效率。因此，灵活高效地选取高活性的gRNA，是进行敲除质粒构建并进一步实现基因编辑的关键。

CRISPR/Cas9 系统的载体构建中，为了方便高效的选取高活性gRNA 序列，提高基因敲除成功率，实验中首先设计3 条靶向拟南芥XTH33 基因的gRNA，通过体外检测手段检测3 条gRNA活性，选取活性最高的靶点XTH33-G3，靶点活性在50%以上，用活性最高的G3 靶点构建敲除质粒pUbi-atU6-gRNA-XTH33。通过体外gRNA 活性活性检测，可以初步判定gRNA 的效率，以便得到高效的敲除质粒，此方法省时省力，加快了实验进度，减少了试错机会，可以节省不必要的费用，并提高了基因敲除成功率。

本实验，成功进行了体外gRNA 活性检测，并构建XTH33 基因的CRISPR/Cas9 高效敲除质粒，为以后高效选取gRNA 提供了借鉴，并为下一步进行XTH33 基因功能鉴定奠定基础。