张华伟 董作祥 蔡学昌 卢东林 刘恒健 孙鹏

[摘要] 目的 探讨衰老对大鼠脑小动脉结构和收缩功能的影响。方法 雄性SD大鼠30只随机分为年轻组和老年组，每组各15只。年轻组大鼠饲养到15周龄、老年组大鼠饲养到65周龄时，取出脑组织，解剖并分离大脑中动脉M1段深入脑实质的小动脉，将其固定在Living system中，在模拟生理情况下，测量两组脑小动脉内外径随压力的变化情况，计算对应的血管结构参数并进行比较。结果 在有钙情况下，老年组血管内径和外径均大于年轻组，差异有统计学意义（F=10.12、10.29，P<0.05）;老年组血管内径变化百分比大于年轻组，差异有统计学意义（F=24.00，P<0.05）。在无钙情况下，老年组血管内径和外径都大于年轻组，差异有统计学意义（F=7.83、17.85，P<0.05）;老年组血管内径变化百分比小于年轻组，差异有统计学意义（F=39.50，P<0.05）。在结构参数方面，老年组血管的管壁厚度、血管壁横截面积、管壁与管径之比大于年轻组，差异有统计学意义（F=7.04～25.86，P<0.05）;老年组的管壁应变和应力小于年轻组，差异有统计学意义（F=40.02、7.05，P<0.05）;此外，老年组的血管硬化程度高于年轻组，差异有统计学意义（t=10.34，P<0.05）。结论 衰老不仅影响脑小动脉的收缩功能，从而影响脑实质局部血流调节，同时也在血管重塑和硬化中起着重要作用。

[关键词] 衰老;弹性模量;血管硬化程度

[中图分类号] R743.1;R592

[文献标志码] A

[文章编号] 2096-5532（2021）04-0487-06

我国已进入老龄化社会，到目前为止我国老龄人口接近3亿，并以每年3%的速度递增。随着老龄人口增加，各种衰老相关疾病的发病人数也明显增加，给社会和家庭带来沉重的负担。其中包括脑小血管相关的疾病，如脑出血、脑梗死以及认知障碍和痴呆等[1-2]。脑小血管包括脑小动脉、小静脉和毛细血管，它们均在脑微循环中发挥着重要作用[3]，其中以脑小动脉的作用最为重要，因为脑小动脉与星形胶质细胞、神经元以及神经胶质细胞共同组成神经血管单位，从而控制和协调局部脑血流和阻力[4]。当脑小动脉结构和功能改变时，必然影响到脑实质的血流动力学参数，继而导致血管内皮细胞损伤、血-脑脊液屏障破坏、炎性渗出以及神经损伤等。大量研究表明，衰老是多种重要生理功能减退的结果，同时也是诸多脑小血管相关疾病的危险因素，随着衰老，脑小血管相关疾病的风险也相应增加[5]，但其发病机制仍然不是很清楚。本研究通过探讨衰老对脑小动脉的结构和收缩功能影响，从而为衰老导致的脑小血管相关疾病发病机制的研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

雄性12周龄SD大鼠（体质量约345 g）30只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，随机分为年轻组和老年组，每组15只，均饲养于SPF级动物实验中心。实验药品包括NaCl、KCl、NaHCO3、CaCl2、MgSO4、HEPES、NaH2PO4和葡萄糖，全部购自于美国Sigma公司。生理盐溶液（PSS）内含：119.0 mmol/L NaCl、4.7 mmol/L KCl、18.0 mmol/L NaHCO3、5.0 mmol/L HEPES、1.2 mmol/L MgSO4、1.6 mmol/L CaCl2、10.0 mmol/L葡萄糖、1.2 mmol/L NaH2PO4，使用前将pH值调整为7.4。

无钙生理盐溶液（PSS0Ca，除不含CaCl2以及增加0.03 mmo/L EDTA之外，其他成分和PSS相同），使用前也需将溶液pH值调整为7.4[6-7]。SZ2体视镜、IMT-2倒置顯微镜（日本Olympus公司）;CH-1 Living system（美国Living systems公司，是一套可以模拟体内生理环境，保持离体血管活性和生理功能的装置），由以下部分组成：可以固定血管的小水槽，压力控制器（调节离体血管腔内的压力），温控装置（维持离体血管温度37 ℃左右），供氧系统（维持相对稳定的氧气含量），图像采集和显示器（实时采集和放大血管图像并对血管内外径进行测量）。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型制备 两组大鼠均自由进食及饮水，避免刺激引起应激反应，人工照明控制昼夜节律各为12 h。年轻组大鼠饲养到15周龄、老年组大鼠饲养到65周龄时进行后续实验。

1.2.2 麻醉及取脑 实验前大鼠在安静环境下休息60 min，称质量后经腹腔注射10 g/L戊巴比妥钠（50 mg/kg体质量）麻醉。待大鼠角膜反射和疼痛反射消失后斩头，剪开头顶皮肤，用咬骨钳分离颅骨，取出大脑，置于冰上预冷的充满PSS0Ca的玻璃皿中。

1.2.3 脑小动脉分离及其在Living system中的安装和固定 在体视镜下用小剪刀沿大脑中动脉（MCA）周围剪开脑组织，取出一块大小约4 mm×7 mm、包含MCA M1段（长度约为2.5 mm）的脑组织，置于另一充满PSS0Ca的玻璃皿中。小心分离出MCA M1段深入脑实质的小动脉，将其转移至Living system小水槽中，小水槽中充满PSS[8-9]。用尖头镊子将脑小动脉一端套在小水槽的玻璃管上，再用6号外科缝线中的单根棉线将其固定，另一端固定在对侧玻璃管上。将小水槽转移到倒置显微镜下并通入混合气体（其中含体积分数0.21的O2和0.06的CO2，0.73的N2），连接控温装置和加压装置，使水槽温度维持在37 ℃，小动脉管腔内充满PSS并将灌注压维持在1.3 kPa。

1.2.4 图像描记和血管内外径测量 图像采集系统采用高分辨率黑白相机，在显示器上小动脉管壁因为透光性差而呈现灰黑色，管腔呈现灰白色，根據色差以两侧血管壁的灰黑色外边界为基准测量血管外径，以两侧血管壁黑色内边界为基准测量血管内径。在含钙的情况下，待温度上升到37 ℃时，按上述方法测量血管内径和外径初始值。等待25～30 min，使血管恢复活力并收缩稳定，依次升高灌注压到1.3、2.7、4.0、5.3、6.7、8.0 kPa，每次升高灌注压后维持3 min，测量有钙情况下血管内径和外径值。有钙情况下血管内径测量结束后，将灌注压降到0.7 kPa，以PSS0Ca置换小水槽中的PSS，反复洗涤6～8次直到血管不再收缩。待温度恢复到37 ℃后，再次测量灌注压分别为0.7、1.3、2.7、4.0、5.3、6.7、8.0 kPa时的血管内径和外径，为无钙情况下血管内径（ID0Ca）和外径（OD0Ca）。

1.2.5 血管结构参数计算[10-14] 管壁厚度（μm）=（OD0Ca-ID0Ca）/2;横截面积（μm2）=（π/4）×（OD0Ca-ID0Ca）;管壁厚度与管径之比=管壁厚度/ID0Ca;管壁应力（σ）=（P×ID0Ca）/2×管壁厚度，式中的P为血管内灌注压;管壁应变（ε）=（ID0Ca-ID0Ca 0.7 kPa）/ID0Ca 0.7 kPa。

血管硬化程度和刚度由弹性模量（E=σ/ε）来反映，弹性模量由应力-应变曲线来表示。应用Microsoft Office Excel软件中最小二乘法对每一根血管对应的两组数据（不同压力下对应的系列血管应变值及系列血管应力值）进行指数曲线拟合，拟合模型σ=σ初始eβε，σ初始为压力在0.7 kPa时初始内径对应的σ值。拟合后每一根血管对应生成一条拟合曲线方程式，方程式中包含确切的σ初始值和β值，将σ初始值和β值的平均值代入拟合模型，并最终得到代表各组应力-应变的综合方程式及对应曲线。拟合曲线中β值为对应曲线的斜率，反映弹性模量的大小，β值增加代表血管刚度和硬化程度增加[13-16]。

1.3 统计学分析

采用GraphPad Prism 7.0软件进行统计学分析，正态分布的计量资料以x2±s表示，两组间比较采用t检验。采用双因素方差分析比较组别和不同灌注压及其交互作用对直径的影响，应用Bonferroni进行两两比较。以P<0.05为差异有显著性。

2 结 果

2.1 脑小动脉内外径随灌注压升高的变化

有钙情况下，年轻组和老年组脑小动脉初始血管内径分别为（25.50±4.20）、（25.67±3.60）μm，两组间比较差异无统计学意义（t=1.79，P>0.05）。灌注压从1.3 kPa升高到8.0 kPa的过程中，血管表现为主动收缩，血管内径组间比较差异有统计学意义（F组别=10.12，P<0.05），不同灌注压比较差异有统计学意义（F灌注压=11.90，P<0.05），二者存在交互作用（F交互=36.36，P<0.05）;单独效应结果显示，灌注压在5.3、6.7、8.0 kPa时，老年组的血管内径大于年轻组（t=3.89～5.06，P<0.05）。见图1A和1B。血管外径组间比较差异有显著意义（F组别=10.29，P<0.05），不同灌注压比较差异有统计学意义（F灌注压=6.81，P<0.05），二者存在交互作用（F交互=17.99，P<0.05）;单独效应结果显示，灌注压在5.3、6.7、8.0 kPa时，老年组的血管外径大于年轻组（t=3.82～4.72，P<0.05）。见图1C。血管内径变化百分比组间比较差异亦有显著意义（F组别=24.00，P<0.05），不同灌注压比较差异有统计学意义（F灌注压=5.92，P<0.05），二者存在交互作用（F交互=15.48，P<0.05）;单独效应结果显示，灌注压在4.0～8.0 kPa时，老年组血管内径增加百分比大于年轻组（t=5.08～7.11，P<0.05），随着灌注压升高，老年组血管持续扩张，而年轻组的血管先收缩，到6.7 kPa时才出现扩张。见图1D。

在无钙情况下，两组在灌注压从0.7 kPa升高到8.0 kPa的过程中，血管表现为被动扩张，血管内径组间比较差异有统计学意义（F组别=7.83，P<0.05），不同灌注压比较差异有统计学意义（F灌注压=176.60，P<0.05），二者存在交互作用（F交互=14.45，P<0.05）;单独效应结果显示，在0.7、1.3、2.7 kPa时，老年组的血管内径大于年轻组（t=3.23～3.86，P<0.05）。见图1E。血管外径组间比较差异有统计学意义（F组别=17.85，P<0.05），不同灌注压比较差异有统计学意义（F灌注压=127.80，P<0.05），二者存在交互作用（F交互=14.15，P<0.05）;单独效应结果显示，灌注压在0.7～8.0 kPa时，老年组的血管外径大于年轻组（t=3.04～5.16，P<0.05）。见图1F。血管内径变化百分比组间比较差异有统计学意义（F组别=39.50，P<0.05），不同灌注压比较差异有统计学意义（F灌注压=158.20，P<0.05），二者存在交互作用（F交互=29.91，P<0.05）;单独效应分析结果显示，灌注压在2.7～8.0 kPa时，老年组血管内径增加百分比小于年轻组（t=2.93～9.99，P<0.05）。见图1G。

2.2 脑小动脉结构参数随灌注压升高的变化

血管壁厚度组间比较差异有显著意义（F组别=7.04，P<0.05），不同灌注压比较差异有统计学意义（F灌注压=9.79，P<0.05），二者不存在交互作用（F交互=2.00，P>0.05）;单独效应结果显示，灌注压在5.3～8.0 kPa时，老年组的血管壁厚度大于年轻组（t=2.78～2.90，P<0.05）。见图2A。血管壁横截面积组间比较差异有统计学意义（F组别=25.86，P<0.05），不同灌注压相比较差异有统计学意义（F灌注压=6.72，P<0.05），二者不存在交互作用（F交互=0.75，P>0.05）;单独效应结果显示，灌注压在0.7～8.0 kPa时，老年组的管壁横截面积大于年轻组（t=4.73～5.22，P<0.05）。见图2B。血管壁厚度与管径之比组间比较差异有显著意义（F组别=7.23，P<0.05），不同灌注压情况下比较差异有统计学意义（F灌注压=43.99，P<0.05），二者存在交互作用（F交互=3.742，P<0.05）;单独效应结果显示，灌注压在5.3～8.0 kPa时，老年组管壁厚度与管径之比大于年轻组（t=2.88～3.23，P<0.05）。见图2C。

管壁应变组间比较差异有统计学意义（F组别=40.02，P<0.05），不同灌注压比较差异有统计学意义（F灌注压 =156.10，P<0.05），二者存在交互作用（F交互=29.54，P<0.05）;單独效应结果显示，灌注压在2.7～8.0 kPa时，老年组管壁应变小于年轻组（t=2.96～9.95，P<0.05）。见图2D。管壁应力组间比较差异有统计学意义（F组别=7.05，P<0.05），不同灌注压比较差异具有统计学意义（F灌注压=230.10，P<0.05），二者存在交互作用（F交互=10.60，P<0.05）;单独效应结果显示，灌注压为6.7、8.0 kPa时，老年组管壁应力值均小于年轻组（t=4.45、5.34，P<0.05）。见图2E。应力-应变曲线拟合模型：年轻组σ=1.31e5.44ε，老年组σ=1.05e9.95ε;曲线的拟合优度：年轻组R2=0.97，老年组R2=0.98;年轻组β=5.44±1.30，老年组β=9.95±1.31，老年组的β值大于年轻组（t=10.34，P<0.05）。见图2F。

3 讨 论

已有研究显示，衰老会导致脑小动脉的肌源性反应一定程度的受损，肌源性反应是维持脑血流自调节的重要机制[17-18]。衰老后，脑小血管肌源性反应受损，可以导致脑血流自调节失常，继而造成血管内皮细胞损伤、神经损害、血-脑脊液屏障破坏、炎性渗出等，并最终导致脑血管疾病、认知障碍和痴呆等[18-22]。衰老情况下，脑血管疾病发病率增高。

动脉重塑主要表现为动脉直径、管壁结构、扩张性能以及硬化程度的变化。动脉重塑是动脉功能减退的主要标志[23]。本研究通过检测在无钙条件下血管被动扩张状态的血管内径、管壁厚度、横截面积等以反映血管的重塑情况。在无钙条件下，随着灌注压的升高，血管因为缺乏钙而无法主动收缩，只能随着灌注压的升高而被动扩张。因此，在无钙的情况下测量血管的各项指标可以反映血管的被动舒张性能。本文结果显示，衰老情况下，血管内径增大，管壁变厚，横截面积增加，管壁厚度与管径之比增大，扩张性能减弱，提示衰老会导致血管重塑、弹性变差，尤其是在血压增高的情况下，更易发生脑血管意外。另外，衰老不是只影响脑的小动脉，很可能其他各器官小动脉都会受累，而小动脉系统具有容量血管和调节血流量的作用，当小动脉扩张性能减弱、弹性变差时，其容量血管和调节血流量的作用势必受影响，这在一定程度上可能会影响外周阻力，从而促进高血压的发生，但需要进一步的实验去证实。

本文研究中脑小动脉的灌注压范围为1.3～8.0 kPa。已有多项研究证实，动脉灌注压会随着血管直径的缩小而逐渐减小，脑表面动脉（直径100～200 μm）的灌注压大约为大动脉的50%以下[24]，即脑表面动脉的灌注压为5.3～8.0 kPa，而脑小动脉的管径则远小于脑表面动脉，因此其正常灌注压比5.3～8.0 kPa更小。已有研究显示，衰老会导致小鼠脑小动脉的重塑[16]，但其使用的灌注压为5.3～16.0 kPa，这远超脑小动脉的正常灌注压，并且也未比较收缩功能的差异，因此并不能真实反映脑小动脉的重塑情况以及自调节的改变。

另外，本文还引入了应力-应变曲线来描述血管的弹性性能和硬化程度。应力-应变曲线又称为弹性模量，是衡量材料产生弹性形变难易程度的指标，其值越大，材料刚度越大，在一定应力下发生弹性形变的能力越小。本文结果显示，对年轻组和老年组的应力和应变进行拟合后，计算得到老年组β值明显大于年轻组，说明老年组的弹性模量明显大于年轻组，因此老年组的脑小动脉具有更差的弹性性能和更高的硬化程度和刚度。进一步证实衰老会导致脑小动脉结构的改变。

综上所述，衰老不仅会影响脑小动脉的收缩功能，从而影响脑实质局部血流量的调节，同时也在血管重塑和硬化中起着重要作用。脑小动脉的这些结构和功能的改变在脑小血管疾病的发病机制中具有重要意义。但是本实验仅局限于体外实验，脑血流的自调节不仅是动脉血管肌源性反应的结果，还受神经、体液等多种因素的影响，因此衰老对脑血流自调节的影响还需体内实验加以验证。

[参考文献]

[1]CHANG G Y. Acute simultaneous multiple lacunar infarcts： a severe disease entity in small artery disease[J]. European Neurology， 2012，68（4）：258.

[2]PARK K Y， CHUNG P W， KIM Y B， et al. Association between small deep cerebellar ischemic lesion and small-vessel disease[J]. Cerebrovascular Diseases （Basel， Switzerland）， 2009，28（3）：314-320.

[3]PANTONI L. Cerebral small vessel disease： from pathogenesis and clinical characteristics to therapeutic challenges[J]. The Lancet Neurology， 2010，9（7）：689-701.

[4]DABERTRAND F， KRIGAARD C， BONEV A D， et al. Potassium channelopathy-like defect underlies early-stage cerebrovascular dysfunction in a genetic model of small vessel disease[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2015，112（7）：E796-E805.

[5]DE SILVA T M， MODRICK M L， DABERTRAND F， et al. Changes in cerebral arteries and parenchymal arterioles with aging： role of rho kinase 2 and impact of genetic background[J]. Hypertension （Dallas， Tex： 1979）， 2018，71（5）：921-927.

[6]GOLDING E M， ROBERTSON C S， BRYAN R M Jr. Comparison of the myogenic response in rat cerebral arteries of different calibers[J]. Brain Research， 1998，785（2）：293-298.

[7]PHILLIPS S A， OLSON E B， MORGAN B J， et al. Chronic intermittent hypoxia impairs endothelium-dependent dilation in rat cerebral and skeletal muscle resistance arteries[J]. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology， 2004，286（1）： H388-H393.

[8]CIPOLLA M J， CHAN S L， SWEET J， et al. Postischemic reperfusion causes smooth muscle calcium sensitization and vasoconstriction of parenchymal arterioles[J]. Stroke， 2014，45（8）：2425-2430.

[9]CIPOLLA M J， SWEET J， CHAN S L， et al. Increased pressure-induced tone in rat parenchymal arterioles vs. middle ce-rebral arteries： role of Ion channels and calcium sensitivity[J]. Journal of Applied Physiology， 2014，117（1）：53-59.

[10]PHILLIPS A A， MATIN N， FRIAS B， et al. Rigid and remodelled： cerebrovascular structure and function after experimental high-thoracic spinal cord transection[J]. The Journal of Physiology， 2016，594（6）：1677-1688.

[11]IZZARD A S， GRAHAM D， BURNHAM M P， et al. Myogenic and structural properties of cerebral arteries from the stroke-prone spontaneously hypertensive rat[J]. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology， 2003，285（4）： H1489-H1494.

[12]KELLY-COBBS A， ELGEBALY M M， LI W， et al. Pressure-independent cerebrovascular remodelling and changes in myogenic reactivity in diabetic Goto-Kakizaki rat in response to glycaemic control[J]. Acta Physiologica， 2011，203（1）：245-251.

[13]BRIONES A M， GONZLEZ J M， SOMOZA B， et al. Role of elastin in spontaneously hypertensive rat small mesenteric artery remodelling[J]. The Journal of Physiology， 2003，552（Pt 1）：185-195.

[14]LEFFERTS W K， AUGUSTINE J A， HEFFERNAN K S. Effect of acute resistance exercise on carotid artery stiffness and cerebral blood flow pulsatility[J]. Frontiers in Physiology， 2014，5：101.

[15]CAI T Y， SULLIVAN T R， AYER J G， et al. Carotid extramedial thickness is associated with local arterial stiffness in children[J]. Journal of Hypertension， 2016，34（1）：109-115.

[16]DOBRIN P B. Mechanical properties of arteries[J]. Physiolo-gical Reviews， 1978，58（2）：397-460.

[17]DAVIS M J. Perspective： physiological role（s） of the vascular myogenic response[J]. Microcirculation （New York， N Y：1994）， 2012，19（2）：99-114.

[18]WILLIE C K， TZENG Y C， FISHER J A， et al. Integrative regulation of human brain blood flow[J]. The Journal of Phy-siology， 2014，592（5）：841-859.

[19]TOTH P， TARANTINI S， CSISZAR A， et al. Functional vascular contributions to cognitive impairment and dementia： mechanisms and consequences of cerebral autoregulatory dysfunction， endothelial impairment， and neurovascular uncoupling in aging[J]. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology， 2017，312（1）： H1-H20.

[20]OGOH S. Relationship between cognitive function and regulation of cerebral blood flow[J]. The Journal of Physiological Sciences： JPS， 2017，67（3）：345-351.

[21]DE HEUS R A A， DE JONG D L K， SANDERS M L， et al. Dynamic regulation of cerebral blood flow in patients with Alzheimer disease[J]. Hypertension （Dallas， Tex： 1979）， 2018，72（1）：139-150.

[22]KISLER K， NELSON A R， MONTAGNE A， et al. Cerebral blood flow regulation and neurovascular dysfunction in Alzheimer disease[J]. Nature Reviews. Neuroscience， 2017，18（7）：419-434.

[23]SILPANISONG J， PEARCE W J. Vasotrophic regulation of age-dependent hypoxic cerebrovascular remodeling[J]. Current Vascular Pharmacology， 2013，11（5）：544-563.

[24]FARACI F M， HEISTAD D D. Regulation of large cerebral arteries and cerebral microvascular pressure[J]. Circulation Research， 1990，66（1）：8-17.

（本文編辑 黄建乡）