李浩月 钟达源 邓奕辉

湖南中医药大学临床医学院，湖南长沙 410208

2 型糖尿病是一种常见疾病，有研究预测2025 年全世界将有3.8 亿糖尿病患者[1]，其中15%[2]合并有糖尿病神经病变，多出现慢性疼痛[3]。目前用于糖尿病神经病变治疗的药物有多种，但临床疗效欠佳[4]，故寻找新的糖尿病神经病变的治疗方法是关键。糖尿病神经病变归属于中医的“消渴”“血痹”等范畴。段力等[5]研究发现，2 型糖尿病周围神经病变是本虚标实，其中标实以血瘀为主。研究[6]表明，丹参酮Ⅱ A 与胰岛素联用能有效抑制周围神经细胞凋亡，升高线粒体膜电位，抑制Bax 和Cytochrome C 转位，还能抑制IκB 蛋白磷酸化和核因子-κB 活化，从而抑制促炎性细胞因子的表达[7]，可见丹参酮Ⅱ A 有活血化瘀的功效。目前丹参酮Ⅱ A 治疗糖尿病神经病变起效的具体机制尚未清晰，因此本文通过网络药理学研究方法进行预测，为其后续的机制研究提供思路。

1 资料与方法

1.1 数据库来源及软件

PubChem 数据库[8]、PharmMapper 数据库[9]、CTD数据库[10]、Cytoscape 3.6.1 软件、OpenBabel-2.4.1 软件、chimera1.14 软件、IGEMDOCK 软件、Pymol 软件、DAVID 数据库[11]、STRING 数据库[12]、PDB 数据库[13]。

1.2 丹参酮Ⅱ A 靶点的收集及处理

通过PubChem 数据库查找丹参酮Ⅱ A 的结构并将其导入PharmMapper 数据库以预测其作用靶点；将靶点名注释后通过STRING 数据库构建蛋白互作网络；通过CTD 数据库检索糖尿病神经病变疾病靶点，将蛋白互作网络中的靶点与疾病靶点相交取共同子集，即得到丹参酮Ⅱ A 治疗糖尿病神经病变的靶点。

1.3 丹参酮Ⅱ A 与疾病靶点的分子对接

通过PDB 数据库下载靶点蛋白的pdb 结构文件并通过chimera1.14 软件进行去配体加氢处理，其次通过PubChem 数据库下载丹参酮Ⅱ A 的sdf 格式文件，再通过OpenBabel-2.4.1 转换成pdb 文件，最后再通过chimera1.14 软件去配体加氢处理后通过IGEMDOCK 软件计算丹参酮Ⅱ A 与靶点蛋白的分子对接结合评分。再通过Pymol 软件进行丹参酮Ⅱ A 与靶点蛋白结合的可视化。

1.4 丹参酮Ⅱ A 治疗糖尿病神经病变关键靶点的GO及KEGG 通路分析

将丹参酮Ⅱ A 治疗糖尿病神经病变的靶点通过DAVID 数据库进行基因本体（gene ontology，GO）及京都基因和基因组数据库（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析；设定显著程度P<0.05。

2 结果

2.1 丹参酮Ⅱ A 靶点的预测与筛选

通过PubChem 数据库查找丹参酮Ⅱ A 的3D 结构并将其导入PharmMapper 数据库以预测其分子对接靶点，以Normfit >0.7 作为筛选参数进行筛选，得到丹参酮Ⅱ A 靶点17 个，分别是AKR1B1、ALB、CASP3、CCNA2、CDK2、EGFR、KDR、MAOB、MAPK1、MAPK14、MAPK8、MMP13、MMP3、NOS3、PPARD、PPARG、RXRA。

2.2 丹参酮Ⅱ A 与靶点蛋白的分子对接得分及结构

将丹参酮Ⅱ A 与17 个靶点蛋白进行分子对接，结果显示丹参酮Ⅱ A 与17 个靶点分子对接评分均＜-6 分，提示丹参酮Ⅱ A 与17 个靶点对接良好。见表1。对接结构见图1。

图1 丹参酮Ⅱ A 与10 个靶点蛋白的分子对接结构

表1 丹参酮Ⅱ A 与17 个靶点蛋白的分子对接得分表

2.3 GO 富集分析

将17 个丹参酮Ⅱ A 治疗糖尿病神经病变的靶点通过DAVID 数据库进行GO 富集分析，以P <0.05进行筛选，发现丹参酮Ⅱ A 治疗糖尿病神经病变主要涉及肽基丝氨酸磷酸化、脂多糖介导的信号通路、凋亡过程的负调控等25 个相关生物功能。见表2。

表2 丹参酮Ⅱ A 治疗糖尿病神经病变的GO 富集分析结果

2.4 KEGG 富集分析

将17 个丹参酮Ⅱ A 治疗糖尿病神经病变的靶点通过DAVID 数据库进行KEGG 富集分析，以P <0.05进行筛选，结果显示丹参酮Ⅱ A 治疗糖尿病神经病变主要涉及TNF 信号通路、FoxO 信号通路、VEGF 信号通路、PI3K-Akt 信号通路等19 条通路；其中PI3K-Akt信号通路、MAPK 信号通路、TNF 信号通路、FoxO 信号通路富集的靶点最多，以这几条通路进行验证的成功率较高。见表3。

表3 丹参酮Ⅱ A 治疗糖尿病神经病变的KEGG 富集分析结果

3 讨论

糖尿病是一个快速增长的慢性系统性疾病，2013 年我国糖尿病患病率已高达10.4%[14]，2016 年全球糖尿病患者约3.82 亿[15]。糖尿病又分为1 型糖尿病和2 型糖尿病，虽然这两种类型糖尿病的发病机制不同，但它们都会导致共同的结果，即高血糖。一旦高血糖发生，两种类型糖尿病患者都有可能发展成同样的慢性并发症。其中以神经病变最为易见，患病率约为50%[16]。目前针对该病多在控制血糖的基础上，辅以营养神经的药物方式来干预，从而改善症状，但该方式未能根治[17]。且由于治疗的长期性，患者的医疗负担较重。中医药是我国宝贵的医疗宝库，其中记载了大量糖尿病神经病变的理法方药，在疾病症状改善及预后方面均有不俗的效果，中医药有可能是糖尿病神经病变新的治疗思路来源。

中医本病属于“消渴”“血痹”的范畴，病机主要包括阴阳气血亏虚和痰瘀内积两个方面，丹参酮Ⅱ A 是从丹参的根中分离出的二萜醌，有活血化瘀的功效。动物实验研究[18]发现，丹参酮Ⅱ A 可以通过抑制内质网应激的激活来减轻神经元凋亡，并改善学习和记忆；刘勇等[6]发现丹参酮Ⅱ A 联用胰岛素能显著改善糖尿病周围神经病变大鼠的糖代谢紊乱；还有研究[19]发现丹参酮Ⅱ A 能够通过减轻炎症反应来改善糖尿病神经病变大鼠的症状，这可能与背根神经节的过度兴奋及钠通道蛋白表达的干预有关[20]；另外有研究[21]认为可能与Nrf2/ARE 信号通路的激活有关。这些研究均显示丹参酮Ⅱ A 对糖尿病神经病变具有确切疗效。

然而糖尿病神经病变是一个复杂的疾病，其与多个靶点、多条途径及多个脏腑均存在联系，因此具体分析丹参酮Ⅱ A 治疗糖尿病神经病变的机制难度较大。网络药理学是研究药物作用机制的新模式[22-23]，可以通过网络化模型对丹参酮Ⅱ A 治疗糖尿病神经病变的靶点、代谢途径及分子机制进行精细化分析。通过该方法，本研究发现丹参酮Ⅱ A 具有多靶点特性，主要涉及肽基丝氨酸磷酸化、凋亡过程的负调控、转录的正调控等25 个相关生物功能，涉及的信号通路有TNF 信号通路、FoxO 信号通路、VEGF 信号通路等19 条通路，其中PI3K-Akt 信号通路、MAPK 信号通路、TNF 信号通路、FoxO 信号通路，以这几条通路进行验证的成功率较高，而这也得到了实验证据[24-28]的支持。本研究结果可以为丹参酮Ⅱ A 治疗糖尿病神经病变的机制研究提供重要参考和依据。