陈晓江，董芙羽，刘晓峰

（1.忻州师范学院生物系，山西 忻州 034000；2.山西臭冷杉省级自然保护区，山西 忻州 034000）

随着工业化和农业的现代化，生活污水和工农业废水排入水环境中的量日益增多，导致水体中氮、磷等营养物质也随排放量不断增加，造成了水体富营养化［1，2］。富营养化水体充足的氮磷营养盐促使藻类暴发式增殖，发生水华现象，水质降低［3］。水华形成的机理是水生态修复研究的热点问题，而通过对外源氮磷污染物总量的控制及运用脱氮除磷技术减少内源污染来治理水体富营养化，以防治水华危害，是水生态修复的主要措施。

目前，对于水华形成机理较好的解释是N/P（氮磷比）学说［3］。Schindler［4］通过控制加拿大安大略实验湖区营养盐试验，研究不同氮磷比（N/P）对藻类生长的影响，得出低N/P能促进鱼腥藻和束丝藻暴发生长。Smith［5］研究了17个湖泊水体的资料提出了通过改变湖泊N/P来减少蓝藻水华的发生，提出营养物质中磷为藻类增殖的关键因子，在不同的氮磷比条件下，不同藻类繁殖速率具有差异性。在水体中，由于N或P的浓度都会导致N/P的变化，所以藻类暴发式生长究竟是N/P还是N、P浓度的作用还需要深入研究。有研究报道对藻类暴发式生长的水华现象是由于水体中P浓度升高引起的，在易暴发水华的富营养化水体中，浮游植物有充足的营养盐支持，而P营养盐由于易形成磷酸盐沉积，所以在水体中，P营养盐浓度降低趋势显著［6］。在刘俊鹏等［7］对地表水体藻类生长增殖的情况研究中，分析得知总磷是限制该地表水体藻类生长的关键因子，且当营养盐磷浓度为0.1 mg/L时会形成轻度硅藻水华，而营养盐磷浓度为0.3 mg/L时会形成重度硅藻水华。王俊等［8］研究说明了磷对杜氏盐藻生长的影响，试验中增加氮和磷都可以促进其繁殖，随着磷浓度含量增加，藻类生长速度提高。唐汇娟［9］综合分析了国内35个湖泊的相关数据，发现在发生水华现象的23个湖泊中，水体中N/P变化为13～35，在没有发生水华现象的12个湖泊中，水体中N/P则小于13。因此有研究者提出水华现象是由于P浓度上升的结果，与N/P的下降无关。以斜生栅藻（Scenedesmusobliquus）为研究对象，通过测定藻类密度值以分析斜生栅藻的生长曲线，并研究适合其生长的磷浓度范围。

1 材料与方法

1.1 材料

试验藻种为斜生栅藻。

试验所用试剂有1.74 g/L硝酸钠、磷酸二氢钠、3 g/L柠檬酸、3 g/L柠檬酸铁胺、0.5 g/L乙二酸四乙酸二钠、1.5 g/L硫酸镁、1.9 g/L氯化钙、20 g/L碳酸钠、2.86 g/L硼酸、1.86 g/L氯化锰、0.22 g/L硫酸锌、0.08 g/L硫酸铜、0.021 g/L钼酸钠。

1.2 方法

采用BG-11培养液为基础培养液，以磷酸二氢钠为添加磷源，通过改变磷酸二氢钠的用量控制培养液中营养盐磷浓度，设置5组不同磷浓度梯度，分别为A1（0.01 mg/L）、A2（0.05 mg/L）、A3（0.1 mg/L）、A4（0.15 mg/L）和A5（0.20 mg/L），如表1所示，并以不添加磷酸二氢钠的培养液为对照组（CK）。配制BG-11培养液需先配制5个Stock，Stock1为分别称取0.3 g柠檬酸、0.3 g柠檬酸铁胺及0.05 g乙二酸四乙酸二钠，用去离子水定容至100 mL；Stock2为分别称取1.74 g硝酸钠、1.5 g硫酸镁，用去离子水定容至1 000 mL；Stock3为称取0.19 g氯化钙溶于去离子水，定容至100 mL；Stock4为称取2 g碳酸钠溶于去离子水中，定容至100 mL；Stock5为分别称取2.86 g硼酸、1.86 g氯化锰、0.22 g硫酸锌、0.021 g钼酸钠以及0.08 g硫酸铜，并用去离子水将其定容至1 000 mL［10］。

表1 6种不同磷浓度的培养液

分 别 量 取2 mL Stock1、20 mL Stock2、2 mL Stock3、1 mL Stock4和1 mL Stock5，用去离子水定容至1 000 mL，将配制好的6种不同磷浓度的培养液分别量取300 mL备用。

1.3 培养条件

准备18个已经清洗、烘干及灭菌过的250 mL锥形瓶，分为3组，即每个浓度设置3次重复，将配制好的不同磷浓度的培养液分别倒入其中，每个锥形瓶平均倒入150 mL，并加入1 mL藻液。充分摇匀后，用封口膜封住锥形瓶瓶口，放入智能培养箱中进行培养。环境条件设置为光暗比为12 h∶12 h，光照为80%，温度为28℃，湿度为60%，培养时间为7 d，培养期间每日早、中、晚各选取固定时间进行人工摇瓶3次，并随机调换锥形瓶位置。

1.4 藻的计数

分别从0、0.01、0.05、0.10、0.15、0.20 mg/L这6个不同磷浓度梯度下取样，利用血细胞计数板在显微镜下观察，3个重复组均要进行统计计数。取样时间为每天16：00，测量取样时，首先摇匀每瓶样液，然后利用移液枪吸取0.1 mL藻液，让藻液渗入血细胞计数板的计数室，在显微镜下观察斜生栅藻的形态，记录藻密度及藻细胞形态的变化，设置3次重复。

1.5 数据处理

藻密度计算公式［11］：

式中，D为藻密度；N为计数板5个中方格的细胞总数；N/5×25为中央大方格细胞总数；n为稀释倍数。

式中，X2为培养某一时间末的藻类密度；X1为培养某一时间开始的藻类密度；（t2-t1）为某一时间段。

数据记录采用Excel 2013软件；数据统计分析利用SPSS17.0软件。

2 结果与分析

2.1 不同磷浓度对斜生栅藻生长的影响

试验组藻密度随培养天数的变化结果如表2所示，随着培养天数的增加，各组藻密度呈增长趋势。在培养1 d后，在磷浓度0.15 mg/L条件下藻密度最高，达30.72×104个细胞/mL，对照组藻密度最低，为11.78×104个细胞/mL；在试验培养2 d、磷浓度0.20mg/L条件下藻密度最大，为36.68×104个细胞/mL，在磷浓度0.05 mg/L条件下藻密度最小，为8.65×104个细胞/mL；在培养3 d、磷浓度0.15 mg/L条件下藻密度最大，为35.78×104个细胞/mL，在磷浓度0.05 mg/L条件下藻密度最小，为20.68×104个细胞/mL；在培养4 d、磷浓度0.20 mg/L条件下藻密度最大，为42.60×104个细胞/mL，在磷浓度0.01 mg/L条件下藻密度最小，为16.58×104个细胞/mL，比培养3 d后的藻密度减少了37.74%；在培养5 d、磷浓度0.10 mg/L条件下藻密度最大，为85.03×104个细胞/mL，在磷浓度0.20 mg/L条件下藻密度最小，为44.25×104个细胞/mL；在培养6 d、磷浓度0.15 mg/L条件下藻密度最大，为107.8×104个细胞/mL，对照组藻密度最小，为70.72×104个细胞/mL；在培养7 d、磷浓度0.20 mg/L条件下藻密度最大，为129.38×104个细胞/mL，对照组藻密度最小，为105.42×104个细胞/mL。

表2 不同磷浓度下斜生栅藻的密度 （单位：104个细胞/mL）

2.2 不同磷水平下斜生栅藻比生长速率

由图1可见，在培养周期内对照组比生长速率最大，为0.44，在磷浓度0.01 mg/L条件下比生长速率次之，为0.38，其中，在磷浓度0.20 mg/L条件下比生长速率最低，为0.26。分析可知，在培养初期，磷浓度对藻类生长有明显的影响，随着培养时间的增加，磷浓度对藻类生长的影响明显降低，在磷浓度为0.15 mg/L时，藻类生长较好，表明藻类生长较适宜的磷浓度为0.15 mg/L。

图1 培养周期内对照组（CK）与试验组（A1、A2、A3、A4和A5）比生长速率比较

由图2可以看出，在藻类培养周期内，试验组相对于对照组每天藻类生长速率波动较大，说明藻类生长受多种条件影响，其生长过程呈非线性。在磷浓度0.20 mg/L条件下藻类比生长速率波动幅度最大，说明在磷浓度较高的条件下，藻类出现暴发式生长。培养5～6 d，除磷浓度0.20 mg/L外，其他各浓度比生长速率均上升，在培养6～7 d、磷浓度0.15 mg/L条件下的比生长速率高于其他浓度，说明磷浓度0.15 mg/L较适宜于藻类生长。

图2 试验组相对于对照组的斜生栅藻比生长速率的变化

2.3 单因素方差分析

为了深入分析磷浓度对藻类生长的影响，对试验组数据进行单因素方差分析，从表3可以看出，组间离差平方和所占比例较小，仅为1.5%，组内离差平方和所占比例较大，为98.5%，据此，说明磷浓度梯度在培养周期内对藻类密度影响不显著，藻类密度受其他相关因子影响较大。

表3 单因素方差分析

从单因素方差分析均值（图3）可以看出，在磷浓度0.15 mg/L条件下，培养周期内藻类密度均值最大，对照组中藻类密度均值最小，磷浓度的增加对藻类生长有促进作用，当磷浓度增加值达0.15 mg/L时，藻类生长密度达到最大，继续提高磷浓度到0.20 mg/L时，藻类生长密度下降，说明磷浓度达0.15 mg/L对藻类生长较为充足，继续提高营养盐磷浓度，藻类生长受到限制。

图3 不同磷浓度梯度下藻类密度均值分析

3 小结与讨论

一般情况下，藻类生长受氮磷比影响，根据研究资料得知，N/P为16∶1称作Redfield比率，在诸多研究中，Redfield比率作为区分藻类生长的营养盐限制类型［13-15］。斜生栅藻是一种在水中对污染物有一定耐受性的单细胞绿藻，常用于检测水环境质量的指示物种［16-18］，本试验选斜生栅藻为试验培养对象，在不同磷浓度梯度条件下培养藻类，结果表明，在营养盐氮充足的条件下，磷浓度对藻类生长初期有促进作用，斜生栅藻在磷浓度0.15 mg/L条件下藻密度最大，磷浓度提高到大于0.15 mg/L时，藻类生长受到限制。陈永川等［19］在研究滇池藻类生长情况与环境因子关系时，通过测量滇池不同区域水体和不同层次水体叶绿素a动态，得出水体叶绿素a的含量年变化与滇池水体总磷呈显著正相关，水体中藻类的生长与总磷及可溶性磷在空间变化上呈显著正相关。本试验结果显示，水体中的磷浓度对斜生栅藻的生长有促进作用。侯秀丽等［20］在研究滇池氮磷营养盐对水体浮游植物结构变化影响中，通过滇池10个监测样点藻类变化与氮磷变化的关系，得出水体中绿藻更加适合较高的氮磷比环境，藻类生长与水体总磷呈显著正相关。在本次试验培养初期，斜生栅藻的形态多由2个藻细胞组成，但随着培养天数的增加，较多地出现4个藻细胞和8个藻细胞的形态，藻密度增加。培养期到5 d时，各试验组的藻密度均明显增加，但是在磷浓度0.20 mg/L条件下，藻密度减小，许海等［21］研究结果显示斜生栅藻在磷浓度达0.20 mg/L时，斜生栅藻达到最大生长速率，提出藻类生长同时受到水体中氮磷比环境条件的影响。蒋鑫艳等［22］在研究乌梁素海叶绿素a时空分布与环境因子关系时，得出总磷是影响乌梁素海叶绿素a的主要水化学因子，总磷与藻类生物量呈显著性正相关。

在营养盐磷浓度水平较低条件下，斜生栅藻生长受到营养盐的限制影响，结果表明，在磷浓度0.15 mg/L条件下斜生栅藻密度达最大值，为129.25×104个细胞/mL。根据试验组相对于对照组的比生长速率数据分析，藻类生长受多种条件影响，其生长过程呈非线性。在磷浓度0.20 mg/L条件下，斜生栅藻培养初期相对于对照组比生长速率最高，表明在较高磷浓度条件下，藻类会出现暴发式增殖，说明水体中较高的磷浓度是水华暴发的原因之一。