万丽丽，王转茸，徐 义，康 雷，杨光圣，辛 强，洪登峰，孙玉宏

（1.武汉市农业科学院作物研究所，武汉 430085；2.华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室，武汉 430070）

1982年德国的Lichter首次报道从甘蓝型油菜中成功分离游离小孢子，并利用小孢子培养诱导单倍体继而加倍获得双单倍体（DHs）［1］。基因型、供体材料的生长环境，小孢子发育阶段、培养基成分以及不同胁迫处理是影响小孢子细胞胚发生以及再生的关键因素［2，3］。研究表明，调整培养基中的渗透压能提高胚发生，32℃热激处理小孢子细胞24～72 h能促进胚的再生。热激处理前将小孢子置于4℃处理24～48 h能增强小孢子的胚发生［4，5］。此外，在诱导培养基中提高蔗糖的浓度、施加活性炭以及秋水仙碱能有效提高小孢子胚再生［6，7］。小孢子培养后得到的胚大多数是球形胚、心型胚或者类似于胚的结构（Embryo-like structures，ELS），只有少数是子叶胚。子叶胚在成苗培养基上能够快速生长获得生长势强、根系发达的植株，通常称其为高质量胚，而其他类型的胚以及类似于胚的结构转移到再生培养基上难以一次成苗，甚至褐化死亡。Kim等［8］建立了辣椒小孢子预培养体系，促使250 000个小孢子再生得到294.6个胚。但由于大多数胚是球形胚和类似于胚的结构，必须转移到再生培养基上才能成苗。这个过程耗时费力，限制了这类胚在育种和遗传转化试验中的应用［9，10］。为能快速获得子叶胚，研究者对培养基中碳源、生长调节剂、脯氨酸和维生素C含量等因素进行筛选，确定有利于子叶胚发育的因素［11-13］。Irikova等［14］研究认为，小孢子再生得到子叶胚取决于2个关键过程，一是小孢子细胞分裂诱导发生过程，二是分裂后继续向胚发生过程。调节培养基中生长素和细胞分裂素比例能够协调这2个递进发育过程［15］。此外，还需要在球形胚阶段前应用ABA以及渗透调节物质促进合子胚和体细胞胚的发生［16］。

尽管甘蓝型油菜中已经建立了小孢子培养技术体系，并成功应用到重要农艺性状QTLs定位、小孢子胚遗传转化、双单倍体的育种实践，但不同基因型油菜小孢子培养获得子叶胚的能力还是存在很大差别。为探索油菜小孢子培养中高质量子叶胚发生的培养体系，本研究在3个不同基因型的F1杂交组合小孢子培养阶段，设置不同培养温度、培养方式、培养基内生长调节剂和活性炭浓度等处理，筛选评价获得能产生子叶胚的培养基以及培养方式，以期为甘蓝型油菜小孢子培养技术的发展提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

将3个油菜F1杂交组合6R×ZS11、7DH×ZS11、ZR×R11种植在田间，每个组合种植6行，共计50个单株。蕾薹期喷施叶面肥，提高抗逆能力，预防早衰，防控菌核病。

1.2 方法

1.2.1 小孢子的分离和收集 在田间摘取3个油菜F1杂交组合材料的主花序和分支的花蕾，放入事先铺上润湿滤纸的塑料盒中。将塑料盒置于4℃展示柜中1 d，次日选取长度3.0～4.2 mm油菜花蕾，此时雄蕊中的小孢子处于单核晚期至二核小孢子早期，将30～40个花蕾置于50%（V/V）次氯酸钠溶液中灭菌10 min，之后转移到无菌ddH2O中浸泡3次，每次10 min。将灭菌处理后的花蕾放入50 mL无菌离心管中，加入10 mL小孢子抽提缓冲液，用研磨棒挤压花蕾，使得小孢子从雄蕊中释放到抽提缓冲液中，补充抽提缓冲液定容到40 mL。含有小孢子的抽提缓冲液经过75μm的过滤网过滤，通过过滤网去除研磨后颗粒较大的花蕾组织，收集过滤后的液体，置于控温15℃离心机中700 r/min离心5 min，保留沉淀物，去除上层液体，加入40 mL抽提缓冲液，轻轻垂悬沉淀中的小孢子细胞，置于控温15℃离心机中700 r/min再次离心5 min，收集小孢子细胞，用NLNM液体培养基（根据NLN13培养基修改，见表1）轻轻垂悬后沉淀进入下一步试验。

表1 NLNM培养基组成成分及配制流程

1.2.2 小孢子预培养 将收集得到的小孢子细胞用NLNM液体培养基垂悬后，使用细胞计数仪将小孢子细胞数调整为20×104个/mL，每个直径为60 mm×20 mm培养皿中加入10～12 mL小孢子悬浮液体，培养皿用Parafilm封口，置于（31±1）℃培养箱中暗培养48 h。

1.2.3 小孢子再生培养 将“1.2.2”步骤中的小孢子液体置于离心温度为15℃的离心机中500 r/m离心5 min，收集得到的小孢子按照1×104个/mL的密度调整。取调整密度后的小孢子悬浮液5 mL加入到直径60 mm×15 mm的培养皿中，之后补充10 mL的NLNM液体培养基，培养皿用Parafilm封口，置于塑料容器中，在25℃下暗培养2周。将小孢子悬浮培养液转移到配制固液双层培养基的90 mm×15 mm培养皿中继续生长。固液双层培养基的组成：上层是NLN13液体培养基，下层是由B5基本培养基+0.1%活性炭+0.25 mg/L 6-BA+3%（m/V）蔗糖+0.5%Phytagel（pH为5.85，高温灭菌）。为保证小孢子悬浮液能够均匀分散在上层液体培养基中，上层NLN13液体培养基体积与转移的小孢子悬浮液的体积为1∶1。小孢子细胞在固-液双层培养基上置于25℃暗培养2周，其中每1～2周补充NLN13液体培养基5 mL。当胚大小肉眼可见，将含有固-液双层培养基的培养皿置于23℃暗室内的摇床上培养，转速为25 r/min。如果再生得到的胚是子叶胚，直接挑选出来转移到再生培养基，再生培养基的组成成分是B5基本培养基+3%（m/V）蔗糖+0.5%Phytagel的固体培养基。如果再生的胚属于非子叶胚（球形胚、心型胚或者类似于胚的结构），用灭菌的小勺子将这类胚转移平铺到再生培养基上，加入5～10 mL NLN13液体培养基浅层覆盖胚组织，培养3～4周，每周及时补充NLN13液体培养基保证胚组织处于被浅层覆盖状态。

1.2.4 小孢子植株再生 经过4周培养后，将正常的子叶胚（含有胚根、下胚轴以及2片对称子叶）转移到再生培养基B5基本培养基+3%（m/V）蔗糖+0.5%Phytagel的固体培养基。在室内培养温度25℃，光周期为16 h光照/8 h黑暗，其中每一层的光合作用光子通量密度PPFD为100μmol/（m·s）。在固体培养基中生长6～8周后转移到土钵中生长。

1.3 数据处理

采用Excel 2010软件计算平均值，SPSS 13.0软件进行方差分析，新复数极差法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 固液双层培养基与液体培养基上再生胚的比较

统计分析不同品系的小孢子细胞在固液双层培养基和液体培养基上的出胚数和高质量子叶胚数目的差异（图1），结果显示，3个品系在液体培养基中的出胚总数高于固液双层培养基；3个品系在固液双层培养中子叶胚数占总出胚数的72.1%、87.0%和85.6%，高于液体培养基上子叶胚数目，并且差异显著（图2）。

图1 在液体培养基和固液双层培养基上甘蓝型油菜小孢子出胚情况

图2 3个甘蓝型油菜品系小孢子在液体以及固液双层培养基上的出胚数目及子叶胚比率

2.2 不同振荡周期培养后的出胚类型以及数目的分析

选取60个花蕾分离的小孢子在25℃暗培养2周，之后转移到固液双层培养基上。将培养皿置于转速为25 r/min的摇床上分别培养1周、2周、3周，培养温度为25℃，统计球型或者心型胚、子叶型胚、类似于胚结构的数目。结果显示，振荡培养1周后的子叶型胚数比未振荡培养的子叶型胚数多，球型或者心型胚的数目显著减少（图3）。

图3 固液双层培养基上振荡培养对出胚的影响

2.3 培养温度与子叶胚产生的相关性分析

将在25℃下暗培养2周的小孢子转移到不同温度（25、23、21、19、17℃）下先振荡培养1周，之后在相应温度下继续静置培养3周，统计出胚总数以及子叶胚数（表2）。结果显示，随着培养温度的降低，平均60个花蕾的出胚总数在降低，在培养温度从21℃降低到17℃时，出胚总数相比在25℃培养温度下出胚数目分别减少了47.2%、71.5%、79.1%。对不同培养温度下子叶胚数目进行统计，结果显示，在23℃培养条件下正常子叶胚的数目占出胚总数的62.1%，显著高于其他培养温度下的子叶胚数目。

表2 不同培养温度对小孢子胚发育的影响

2.4 固液双层培养基上不同浓度活性炭对子叶胚数的影响

为提高子叶胚数目，通过设置双层培养基中固体成分中活性炭的浓度梯度，筛选最优活性炭的浓度（表3）。试验结果显示，在添加0.10%活性炭的固液双层培养基中子叶胚数最多，显著性高于其他浓度的培养基。

表3 不同浓度活性炭对小孢子出胚数和子叶胚数的影响

2.5 不同浓度6-BA对小孢子出胚的影响

在固液双层培养基上，添加不同浓度6-BA后统计小孢子出胚数和子叶胚数，结果显示，在0.256 mg/L 6-BA处理后，平均60个花蕾的出胚总数最多，达到97.2个，显著高于其他处理浓度下的出胚总数，并且高质量子叶胚数目也最多，与其他处理差异显著（表4）。

表4 不同浓度6-BA处理下小孢子出胚数和子叶胚数

2.6 不同类型的胚在生根培养基上一次性成苗率分析

将子叶胚转移到再生培养基B5基本培养基+3%（m/V）蔗糖+0.5%Phytagel的固体培养基，将球型或心型胚以及类似于胚的结构转移到上述固体培养后加入浅层NLN13培养基，将这类非子叶胚覆盖。生长4周后统计上述主要3种类型的胚直接转化成植株，形成次生胚后转化成植株，形成愈伤组织后转化成植株以及胚褐化死亡的数目（表5）。结果显示，3个品系中的子叶胚直接转化成植株的数目显著高于球型或心型胚以及类似于胚的结构转化成植株的数目，在培养基中子叶胚死亡数目显著低于类似于胚结构的死亡数。

表5 3个甘蓝型油菜品系不同类型胚转化成植株的数量

3 讨论与结论

小孢子培养所得到的愈伤和胚进一步成苗的能力取决于培养基的成分。相比液体培养基，在固体培养基上所得到的胚生活力和成苗的能力更强。本研究结果得出，3个F1家系在液体培养基上所得到的胚大多数是球形或者类似于胚的结构，子叶胚数目较少，而在固-液双层培养基上能够产生大量的子叶胚。前人采用双层培养基通常是组成成分相同的液体和固体培养基［17，18］，而本试验中所配制的双层培养基中下层的固体成分由B5、活性炭以及6-BA组成，上层液体培养基由NLN13组成，这样的双层培养基中子叶胚出胚率高。液体培养基中胚的产量高，而在固体培养基上胚的质量优。Li等［19］研究中发现，将大麦的小孢子细胞在液体培养基上培养3周，将类似于胚的结构转移到固体培养基上继续培养3周，再生获得胚的数目显著高于在液体培养基上连续培养6周所得数目，并且直径大于1.5 mm的胚数目多，更容易进一步发育成苗。在本研究中发现，虽然固-液双层培养基上所得到的胚总数目少于液体培养基，但是子叶胚的数目在总数中所占比率显著增加。相比固体培养基上培养，小孢子细胞在液体中培养更容易产生愈伤组织，可能是由于液体培养基较好的流动性使小孢子细胞和营养物质紧密接触的同时，也受到了有害物质或者生长抑制物的干扰，有部分聚集在培养皿底部的胚生长缓慢，甚至死亡［20，21］。为改良小孢子细胞发育的生长环境，可不断更新液体培养基和降低培养温度等方法来减少抑制物的产生。小孢子胚发生过程受到乙烯、ACC（乙烯合成的前导物质）以及乙烯利等抑制物质的胁迫，人为施加乙烯合成抑制剂如活性炭能够促进胚发生［22］。此外，芥菜型油菜小孢子培养中加入PCIB等拮抗乙烯产生的物质后能产生大量的柠檬型胚、香蕉型胚或者飞碟型胚，证明了抑制了乙烯的产生也会抑制子叶的延伸和正常生长。根据小孢子细胞发育的时期，调整合适浓度的活性炭以及PCIB等成分保证了出胚数目和胚的质量［23］。

本研究通过两步法培养（先液体培养后固液双层培养）油菜小孢子细胞具有3个方面的优势：①NLNM液体培养基促进小孢子细胞的胚诱导发生。②在固液双层培养基上能够经过固体培养基上的活性炭吸附液体培养基中释放的有害物质，同时不影响液体培养基对小孢子胚的营养供给；经过振荡培养起到增氧的作用，固体培养基中添加的6-BA为小孢子胚的发育提供基本的生长调节物质；将液体培养基中小孢子再生的胚转移到固体培养基上后可以在获得更多营养的同时稀释培养液中的有毒物质。③培养小孢子细胞2～3周后降低培养温度，虽然会抑制胚前发育阶段，但是对胚后发育阶段有利，有助于小孢子胚从圆形结构向球型胚阶段转化，有效提高胚的质量，同时能够促进胚向植株的转变。

综上所述，本研究中所建立的油菜高质量子叶胚培养的技术体系既能提高出胚数量，同时还能保证子叶胚，提高了小孢子培养获得双单倍体的效率。