杨晓婷

（昌宁县农田和农村能源管理站，云南昌宁 678100）

昆虫取食和机械损伤时植物体同时存在保护酶系统，能够清除体内多余的自由基。抗氧化系统实际就是保护酶系统，它由许多酶和还原性物质组成，其中超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）是主要的抗氧化酶，植物提高对逆境的抗性是通过抗氧化酶加强抗氧化作用，从而防治自由基毒害。SOD的活性氧胁迫，是植物在逆境胁迫条件下产生的，对于清除超氧自由基起关键作用。CAT是一种抗氧化酶，在植物体组织中普遍存在，是生物氧化过程中一系列抗氧化酶的终端，能够有效清除植物体内多余的H2O2。POD是活性较高的适应性酶，能够反映体内代谢状况以及对外环境的适应性、植物生长发育的特性。

从春雷等研究了西花蓟马取食与机械损伤对菜豆叶片抗氧化系统的影响，发现西花蓟马取食与机械损伤两种处理诱导及处理诱导时间的不同导致（SOD、POD、CAT）三种抗氧化酶活性有不同程度的升高，但变化规律不完全相同，西花蓟马对菜豆叶片的取食诱导明显高于机械损伤对菜豆叶片抗氧化系统的影响。从春雷等对蓟马取食、机械损伤以及外源物对菜豆叶片的防御酶活性影响的研究，结果表明不同处理可诱导菜豆植株产生明显的防御反应。其他昆虫的取食和机械损伤也可以引起植物体内保护酶活性的变化，如MithoFer等研究表明，海灰翅夜蛾Spodoptera littoralis （Boisduval）取食和机械损伤处理后利马豆Phaseolus Lunatus（Linnaeus）叶片内SOD、CAT及POD的活性均升高。毛红等研究绿盲蝽取食与机械损伤对棉花叶片内防御酶活性的影响，结果表明绿盲蝽取食诱导不同抗性叶片的PAL、POD和PPO的活性显著升高，机械损伤处理后，PAL、POD和PPO的活性变化没有绿盲蝽取食诱导的明显。本研究说明，这些酶活性的变化与逆境条件和胁迫时间有关。王艳颖等机械损伤对富士苹果抗氧化酶活性的影响的研究表明，机械损伤显著的影响了抗氧化酶的活性变化。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验虫源

从周边的葱地采集烟蓟马成虫，放到实验室60 cm×60 cm×60 cm的养虫笼中进行养殖，实验室温度在20～30 ℃适合烟蓟马成虫的生长繁殖。在花盆上栽种小葱放到养虫笼里供烟蓟马成虫食用。

1.1.2 不同处理操作

对照处理：在温室大棚里栽种20盆小葱，待葱长大之后健康未受损小葱叶片作为空白对照。

取食诱导处理：取10 cm长的健康小葱葱叶两根，每根截成长度相等的3段放入玻璃管，用自制的吸虫器吸取40头烟蓟马成虫放入玻璃管，立即用生物膜白处理，封上管口开始计时，进行烟蓟马的取食处理。

机械损伤诱导处理：在花盆上找到健康未受损的葱叶，用消过毒的针头在葱叶上等距离刺10个孔作为机械损伤，并开始计时，做好标记。

1.1.3 实验主要试剂与仪器

试验主要试剂：测定植物三种保护酶试剂盒中的各种试剂，包括0.1mL/L磷酸盐pH值7.0～7.4缓冲液、双蒸水、Nacl。

试验主要仪器：光照培养箱、电子天平、吸虫管、容量瓶、昆虫饲养笼、移液枪、药匙、试管、水浴锅、低速冷冻多管离心机、离心管、玻璃棒、小刀、分光光度计。

1.2 试验方法

1.2.1 过氧化物酶（POD）的活力测定

称取小葱叶片1 g，为制备不同浓度的匀浆液加入不同量的Nacl，在0 ℃冰箱内静置3 min后取出，立即机械匀浆，3500 r/min的条件下离心10 min，取上清液待测。待测液于420 nm处显色反应，步骤（见表1）。

表1 测定POD活性试剂用量（mL）

1.2.2 超氧化物歧化酶（SOD）的活力测定

称取小葱叶片1g，为制备不同浓度的匀浆液加入不同量的0.1mL/L磷酸盐pH值 7.0～7.4缓冲液，在0℃冰箱内静置3 min后取出，立即机械匀浆，3500 r/min的条件下离心10 min，取上清液待测。待测液于550 nm处显色反应，步骤（见表2）。

表2 测定SOD活性试剂用量（mL）

1.2.3 过氧化氢酶（CAT）的活力测定

称取小葱叶片1g，为制备不同浓度的匀浆液加入不同量的生理盐水，在0℃冰箱内静置3 min后取出，立即机械匀浆，3500 r/min的条件下离心10 min，取上清液待测。待测液于405 nm处显色反应，步骤（见表3）。

表3 测定CAT活性试剂用量（mL）

2 结果与分析

2.1 组织匀浆浓度和不同处理对小葱超氧化物歧化酶活力的影响

2.1.1 组织匀浆浓度对小葱超氧化物歧化酶活性的影响

根据匀浆浓度与绝对OD值绘制标准曲线，由图1可知，当组织匀浆浓度为0.03g/mL以后，绝对OD值变趋近于0.6，浓度再升高，绝对OD值差异不大。所以当组织匀浆浓度为0.03g/mL时，超氧化物歧化酶活性趋近于最大值。

图1 匀浆浓度与绝对OD值变化趋势图

2.1.2 不同处理对超氧化物歧化酶活力的影响

烟蓟马取食与机械损伤诱导处理小葱叶片后，SOD的活力在不同时间内表现不同。诱导24 h时取食诱导葱叶内SOD活力与健康植株相比无明显变化，机械损伤处理明显高于健康植株；诱导48 h时烟蓟马取食和机械损伤处理SOD活力明显高于健康植株；诱导72 h时烟蓟马取食处理SOD活力升高到最高值，至96 h时酶活力略有下降，但仍然高于健康植株，机械损伤处理和健康植株酶活力无明显变化（见表4）。

表4 不同处理的SOD活力时间变化（U/g）

由图2可知，健康植株活力在不同时间保持不变在77 U/g附近；机械损伤在处理24 h时就达到了最大值123 U/g，后逐渐下降；烟蓟马取食处理是一个先上升后下降的过程，在72 h时达到最高点123 U/g。

图2 不同处理的SOD活力时间变化

2.2 组织匀浆浓度和不同处理对小葱过氧化物酶活力的影响

2.2.1 组织匀浆浓度对小葱过氧化物酶活性的影响

由图3可看出，当植物组织匀浆浓度在0.04 g/mL以后，绝对OD值在0.45附近，浓度再增加绝对OD值变化不大，所以组织匀浆浓度为0.04 g/mL时活性趋近最大值。

图3 匀浆浓度与绝对OD值变化趋势图

2.2.2 不同处理对过氧化物酶活力的影响

烟蓟马取食和机械损伤诱导对POD活力的影响在不同时间范围有所不同。由表5可知，诱导处理24 h时，机械损伤和取食诱导处理对葱叶内POD活力无明显影响；48 h时两种诱导处理的POD活力明显高于健康植株，但两处理之间无显著差异；至72 h时两处理的葱叶POD活力均达到最高值，且明显高于健康植株，烟蓟马取食诱导的POD活力也明显高于机械损伤。随后酶活力下降；到96 h时两种处理与健康植株均无明显差异。

表5 不同处理的POD活力时间变化（u/g）

由图4可看出，健康植株在不同时间的变化过程中，POD活性变化不明显，活力值接近60 U/g；机械损伤处理POD活力是先上升后下降，在72 h时达到最大值97 U/g，后下降至与健康植株差别不大；烟蓟马取食处理也是先上升后下降的过程，在72 h时达到最大值133 U/g，后下降到健康植株酶活力水平。

图4 不同处理的POD活力时间变化

2.3 组织匀浆浓度和不同处理对小葱过氧化氢酶活力的影响

2.3.1 组织匀浆浓度对小葱过氧化氢酶活性的影响

根据匀浆浓度与绝对OD值绘制标准曲线（图5），由图可看出当匀浆浓度为0.03 g/mL以后，绝对OD值趋近于0.35，浓度再升高，绝对OD值变化不大，所以当组织匀浆浓度为0.03 g/mL时，过氧化氢酶活性趋近于最大值。

图5 匀浆浓度与绝对OD值变化趋势图

2.3.2 不同处理对过氧化氢酶活力的影响

烟蓟马取食与机械损伤对小葱CAT活力在时间范围内也有明显变化。24 h时机械损伤与取食诱导处理酶活力都略高于健康植株；至48 h时诱导处理叶片与健康植株相比差异显著；72 h时烟蓟马取食处理酶活力显著上升，机械损伤处理下降，但仍然高于健康植株；96 h时烟蓟马取食上升至最大值，机械损伤和健康植株酶活力无明显差异，（见表6）。

表6 不同处理的CAT活力时间变化（U/g）

（续上表）

由图6可看出，健康植株在不同时间CAT活力无明显变化，活力值接近45 U/g；机械损伤是一个先上升后下降的过程，在48 h时达到最高值91 U/g，后下降到和健康葱叶活力无明显差异；烟蓟马取食诱导是一个逐渐上升的过程，在96 h时达到最高值。

图6 不同处理的CAT活力时间变化

3 结 论

3.1 蓟马取食与机械损伤对过氧化物酶活力的影响

蓟马取食诱导处理SOD活力随处理时间不断上升，最大值出现在72 h时（123.48 U/g），至96 h时SOD活力已降至与48 h时接近；机械损伤处理在24 h时就达到了最大值（123.84 U/g），之后SOD活力一直下降，至96 h时与健康植株接近；两诱导处理叶片SOD活力显著高于健康植株，在整个诱导处理过程中，烟蓟马取食诱导SOD活力也明显高于机械损伤诱导。

3.2 烟蓟马取食与机械损伤对超氧化物歧化酶活力的影响结果

烟蓟马取食诱导处理、机械损伤诱导处理POD活力变化均为先上升后下降。诱导处理24 h时，机械损伤和取食诱导处理对葱叶内POD活力无明显影响；48 h时两种诱导处理的POD活力明显高于对照处理；至72 h时两处理的葱叶POD活力均达到最高值，且明显高于健康植株，烟蓟马取食诱导POD活力也明显高于机械损伤诱导；到96 h时两种处理与健康植株均无明显差别。

3.3 烟蓟马取食与机械损伤对过氧化氢酶活力的影响结果

机械损伤诱导处理CAT活力变化是先上升后下降，最大值出现在48 h时（91.22 U/g）之后不断下降，至96 h时与对照接近；烟蓟马取食诱导24 h时CAT活力比健康植株略高，之后一直上升，96 h时酶活力达到最大值（96.47 U/g）；烟蓟马取食诱导处理CAT活力最大值略高于机械损伤诱导处理。

总之，烟蓟马取食诱导和机械损伤处理对葱叶内过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）活力均有影响，影响度是：烟蓟马取食处理＞机械损伤处理＞对照处理；保护酶活性在诱导的不同时间段变化规律也不完全相同，烟蓟马取食处理对小葱保护酶的影响高于机械损伤处理。