梁雨娜 程杰 张屏 包保全 刘德旺 唐雨晨

【摘 要】 目的：建立蒙药阿格希日嘎中生物碱含量的测定方法。方法：采用酸性染料比色法测定蒙药阿格希日嘎的总生物碱含量。结果：介芬胺在浓度0.001988～0.03976 mg·mL-1范围内呈良好的线性关系，平均回收率为96.6%，RSD为2.00%。结论：该方法精密度高，重复性好，操作简单，可为蒙药阿格希日嘎总生物碱含量的检测提供实验依据。

【关键词】 阿格希日嘎;生物碱;酸性染料比色法

【中图分类号】R29 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2021）14-0034-05

Abstract：Objective To establish a method for the determination of alkaloids in the Mongolian medicine Veratri Nigri Radix et Rhizoma.Method The acid dye colorimetry method was used to determine the total alkaloids content of Mongolian medicine Veratri Nigri Radix et Rhizoma.Results The linear range of jervine was 0.0202～0.0303 mg·mL-1. The average recovery was 96.6% and the RSD was 2.00%.Conclusion The method is simple and accurate with good reproducibility， to detect the total alkaloid content of the Mongolian medicine Veratri Nigri Radix et Rhizoma.

Keywords：Mongolian Medicine Veratri Nigri Radix et Rhizoma; Alkaloids; Acid Dye Colorimetry

蒙药阿格希日嘎，异名“杜日吉德”、“扎洛尔钦”，中文名藜芦，为百合科植物藜芦Veratrum nigrum L.的干燥根及根茎。分布于内蒙古呼伦贝尔盟、哲里木盟，赤峰和锡林郭勒盟;以野生资源入药;春季抽花茎前采挖，除去苗叶，泥沙，晒干[1-2]。本品为蒙药寒热症总泻药，味苦、辛，性平，效锐、糙、重、浮、稀，有毒，具有泻下、催吐之功效，用于治疗“希拉”病、消化不良、铁垢巴达干，剑突痞，痧症，虫症，疫热，胎衣不下，水肿，疮疽等[3-5]。藜芦属植物的主要活性成分有甾体生物碱类、二苯乙烯类、黄酮类等[6-8]。其中，甾体生物碱具有抗癌、抗病毒、镇咳、抗炎、降血压、防止血栓生成等多种生物活性，也是藜芦的主要毒性成分。近年来，其抗癌活性的研究成为热点，作用机制包括Hedgehog信号通路、Caspase-3依赖的细胞凋亡、细胞周期和自噬等[9-10]。迄今为止，已从藜芦属植物中分离得到甾体生物碱70多种，已建立藜芦胺、介芬胺等成分的高效液相色谱法[11-12]，但尚无有关藜芦总碱含量测定的文献报道。

酸性染料比色法具有灵敏度高和操作简便的优点，是测定中药总生物碱含量的经典方法之一[13-14]。本实验通过对酸性染料比色法的染料種类、酸性染料用量、测定波长、缓冲液的选择及其pH等因素[15]进行考察，首次建立测定蒙药阿格希日嘎中总生物碱含量的最佳酸性染料比色方法，为蒙药阿格希日嘎的质量评价提供参考与依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 岛津UV-1280紫外可见分光光度计（日本Shimadzu公司）;AB135-S十万分之一分析天平（瑞士METTLER TOLED公司）;WR-100型微型粉碎机（鹤壁市天冠仪器仪表有限公司）;KQ2200超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）;HH-4数显恒温水浴锅（国华电器有限公司）;PHS-3E型精密pH计（上海仪电科学仪器股份有限公司）。

1.2 试药 介芬胺（批号：YL-2013091833，纯度：98.0%，上海一林生物科技有限公司，供含量测定用）;溴甲酚绿（天津市大茂化学试剂厂）;溴百里香酚兰（天津市大茂化学试剂厂）;枸橼酸（天津博迪化工股份有限公司）;枸橼酸钠（天津市大茂化学试剂厂）;磷酸氢二钠（天津市化学试剂批发公司）;邻苯二甲酸氢钾（天津博迪化工股份有限公司）;氢氧化钠（天津市津东天正化学试剂厂）;三氯甲烷（天津市津东天正化学试剂厂）;甲醇（天津市津东天正化学试剂厂）;水为蒸馏水。

1.3 药材 蒙药阿格希日嘎样品于2018年6月采自内蒙古、黑龙江、吉林3个不同的产区，每个产区采集6批样品，采集地点详见表1。包保全教授进行原植物鉴定为百合科植物藜芦Veratrumnigrum L.，模式标本存放于内蒙古医科大学药学院标本室。取其根及根茎，去除泥沙，于阴凉处干燥，即得。中药藜芦样品于2020年9月购自河北省安国药材市场，包保全教授进行原植物鉴定为百合科植物藜芦Veratrumnigrum L.，编号Z2020。

2 方法与结果

2.1 试验溶液的制备

2.1.1 对照品溶液的制备 称取介芬胺对照品约5 mg，精密称定，置于5 mL量瓶中，加三氯甲烷溶解并定容至刻度。精密量取1 mL，置于10 mL量瓶中，用三氯甲烷稀释至刻度，摇匀，得浓度为0.0994 mg·mL-1的对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备 取本品粉末约 1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加浓氨试液2 mL，浸润1 h，加三氯甲烷-甲醇（4∶1）混合溶液40 mL，置80 °C水浴加热回流2 h，放冷，滤过，滤液置50 mL量瓶中，用适量三氯甲烷-甲醇（4∶1）混合溶液洗涤药渣2～3次，洗液并入同一量瓶中，加三氯甲烷-甲醇（4∶1）混合溶液至刻度，摇匀。精密量取1 mL，置25 mL具塞试管中，水浴上蒸干，精密加入三氯甲烷10 mL使溶解，即得供试品溶液[16-17]。

2.2 测定条件的选择

2.2.1 酸性染料种类的选择 精密量取“2.1.1” 项下对照品溶液2 mL，置25 mL具塞试管中，水浴上蒸干，精密加入三氯甲烷10 mL使溶解。精密加水5 mL、再精密加0.04%溴甲酚绿缓冲液（取溴甲酚绿0.04 g，用pH值为4.0的邻苯二甲酸氢钾-氢氧化钠溶液溶解并稀释至100 mL，即得）2 mL，密塞，剧烈振摇1 min，转移至分液漏斗中，放置30 min。取三氯甲烷液，用干燥滤纸滤过，取续滤液，以相应的试剂为空白。同法制备溴百里香酚兰溶液组。照紫外-可见分光光度法（通则0401），进行全波长扫描测定吸光度。根据结果可知，溴百里香酚兰空白对照溶液在300～500 nm范围内有较大吸光度，干扰较大;溴甲酚绿与供试品提取液形成的离子对在300～500 nm范围内的最大吸光值度最高，故酸性染料确定为溴甲酚绿。

2.2.2 缓冲溶液的选择 精密量取“2.1.1” 项下对照品溶液2 mL，置25 mL具塞试管中，水浴上蒸干，精密加入三氯甲烷10 mL使溶解。精密加水5 mL、再精密加0.04%溴甲酚绿缓冲液2 mL，密塞，剧烈振摇1 min，转移至分液漏斗中，放置30 min。取三氯甲烷液，用干燥滤纸滤过，取续滤液，以相应的试剂为空白。同法制备枸橼酸-枸橼酸钠，枸橼酸-磷酸氢二钠缓冲盐溶液组。照紫外-可见分光光度法（通则0401），进行全波长扫描。根据结果可知，邻苯二甲酸氢钾-氢氧化钠缓冲溶液中离子对吸光度最大，故缓冲溶液确定为邻苯二甲酸氢钾-氢氧化钠溶液。

2.2.3 缓冲溶液pH的选择 精密量取“2.1.1”项下对照品溶液2 mL，置25 mL具塞试管中，水浴上蒸干，精密加入三氯甲烷10 mL使溶解。精密加水5mL、再精密加0.04%溴甲酚绿缓冲液2 mL，密塞，剧烈振摇1 min，转移至分液漏斗中，放置30 min。取三氯甲烷液，用干燥滤纸滤过，取续滤液，以相应的试剂为空白[18]。同法制备pH 值3.8、4.0、4.2时的溶液。照紫外-可见分光光度法（通则0401），进行全波长扫描。根据结果可知，pH值为4.0时离子对提取液组吸光度最大，故缓冲溶液pH 值应为4.0。

2.2.4 酸性染料用量的选择 精密量取“2.1.1” 项下对照品溶液2 mL，置25 mL 具塞试管中，水浴上蒸干，精密加入三氯甲烷10 mL使溶解。精密加水5mL、再精密加0.04%溴甲酚綠缓冲液2 mL，密塞，剧烈振摇1 min，转移至分液漏斗中，放置30 min。取三氯甲烷液，用干燥滤纸滤过，取续滤液，以相应的试剂为空白。同法制备酸性染料浓度为0.3、0.4、0.5 mg·mL-1的溶液。照紫外-可见分光光度法（通则0401），进行全波长扫描。根据结果可知，酸性染料浓度为0.4 mg·mL-1时离子对吸光度最大，故酸性染料浓度为0.4mg·mL-1。

2.2.5 测定波长的选择 精密量取“2.1.1” 项下对照品溶液2 mL，置25 mL具塞试管中，水浴上蒸干，精密加入三氯甲烷10 mL使溶解。精密加水5 mL、再精密加0.04%溴甲酚绿缓冲液2 mL，密塞，剧烈振摇1 min，转移至分液漏斗中，放置30 min。取三氯甲烷液，用干燥滤纸滤过，取续滤液，以相应的试剂为空白[18]。同法制备空白对照组、供试品溶液组。照紫外-可见分光光度法（通则0401），进行全波长扫描。结果表明，介芬胺对照品和供试品溶液均在411 nm处有最大吸收，空白溶液则无吸收，结果如图1所示，故选411 nm为测定波长[19]。

2.3 酸性染料比色法的方法学考察

2.3.1 标准曲线的制备 精密量取“2.1.1”项下对照品溶液0.2 mL、0.5 mL、1 mL、2 mL 、3mL、4 mL，置25 mL具塞试管中，水浴上蒸干，精密加入三氯甲烷10 mL使溶解。按“2.2.5”项下方法处理显色后，于411 nm 波长处测定吸光度值，记录吸光度。以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。介芬胺回归方程y =31.521x+0.078，r = 0.9993。结果表明，介芬胺的浓度在0.001988～0.03976 mg·mL-1范围内与吸光度呈良好的线性关系[20]。

2.3.2 精密度试验 取“2.1.2”项下供试品溶液（编号：MH-1），按“2.2.5”项下方法处理显色后，于411 nm 波长处测定吸光度值。连续测定6次，结果，RSD值<1.15%（n=6），表明本方法精密度良好。

2.3.3 稳定性试验 取“2.1.2”项下供试品溶液（编号：MH-1），按“2.2.5”项下方法处理显色后，取三氯甲烷层分别于室温下放置0、4、8、10、12 和24 h，于411 nm 波长处测定吸光度值。结果，RSD值<2.15%（n=6），表明供试品溶液室温下放置24 h内稳定。

2.3.4 重复性试验 按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液（编号：MH-1），共6份，按“2.2.5”项下方法处理显色后，于411 nm 波长处测定吸光度值。结果，阿格希日嘎中总生物碱平均百分含量为5.801mg·g-1，RSD值<1.75%（n=6），表明本方法重复性良好。

2.3.5加样回收试验 称取本品粉末（编号：MH-1）共9份，每份约0.5 g，精密称定，分别置于具塞锥形瓶中，分别按样品中生物碱含量的80%、100%、120%加入对照品，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.5”项下方法处理显色后，于411 nm 波长处测定吸光度值，并计算回收率[21]。结果平均回收率为96.6%（RSD=2.00%），结果见表2。

2.4 样品含量测定 分别称取内蒙古、黑龙江、吉林3个产地（每个产地6个批次）的18批蒙药阿格希日嘎样品，和中药商品藜芦样品，每份约1g，精密称定，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.5”项下方法处理显色后，于411nm波长处测定吸光度值度，根据标准曲线计算总生物碱含量，结果见表3。

3 讨论

3.1 提取方法的选择 蒙药阿格希日嘎中生物碱结构多为甾体生物碱，与百合科植物贝母中生物碱结构相近，故该实验中生物碱的提取方法参照《中国药典》2015年版中川贝母中生物碱的提取方法，采用氨水浸润后，再用混合溶剂加热回流提取，课题组前期研究表明，此方法对蒙药阿格希日嘎总生物碱的提取效果也很好[22]。

3.2 实验条件的确定 本实验通过对酸性染料比色法的染料种类、酸性染料用量、测定波长、缓冲液的选择及其pH等因素进行了考察，最终确定了酸性染料为溴甲酚绿、缓冲液为邻苯二甲酸氢钾-氢氧化钠溶液、缓冲液的pH为4.0、酸性染料浓度为0.4 mg·mL-1时，测得离子对在411 nm处吸光度最大。该方法具有一定的专属性和准确度，灵敏度高，简便易行，适用于蒙药阿格希日嘎中总生物碱含量的测定。

3.3 不同产区藜芦生物碱含量存在显著差异 不同产区藜芦总生物碱差异显著，内蒙古呼伦贝尔的总生物碱含量最高，黑龙江漠河和吉林辽源较少，分别为7.560、5.520、5.524 mg·g-1，而中药藜芦中总生物碱含量高达10.298 mg·g-1。课题组前期研究表明中药藜芦与蒙药阿格西日嘎两者之间生物碱的种类具有明显差异，蒙药阿格希日嘎中介芬胺和藜芦胺含量极少[5]。植物次生代谢产物的积累与外界环境（海拔、光照、气候、土壤等） 密切相关，不同植物不同的次级代谢产物受环境因子的影响程度不一样[23]。由此，推测藜芦生长环境因素差异导致了不同产地的生物碱的含量不同。

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（收稿日期：2020-12-14 编辑：程鹏飞）