张月江 张新永 李艳娇 邢江艳 林 奇 包媛媛

(云南农业大学，昆明 650000)

美藤果(Sacha Inchi)又名印加果、南美油藤、星油果等，是一种大戟科木质藤本植物[1，2]。美藤果原产中美洲、南美洲和东南亚等地区[3]，目前已大面积引种云南西双版纳、红河等地区[4]。2013年美藤果油被卫生部正式批准为新资源食品[5]，其是以美藤果种籽为原料, 经脱壳、粉碎、压榨、过滤等工艺制成的淡黄色透明油状液体。Páucar等[6]采用酸败法对美藤果油货架期评价，在20 ℃时美藤果油货架期可达到3.29年。薛莉等[7]报道美藤果油中甾醇含量高于其他常见植物油，让美藤果油具有较强的氧化稳定性。

以核桃为原料加工的天然核桃油脂，在市场上备受消费者青睐[8]，然而目前核桃油加工产业核心是核桃油稳定性问题[9，10]。为解决核桃油氧化问题，添加抗氧化剂，然而常用抗氧化剂TBHQ会对动物有致突变，BHA和BHT有致癌[11]。核桃油中甾醇含量为β-谷甾醇(75.10±19.26) mg/100 g；豆甾醇(17.49±9.34) mg/100 g[12]。有报道甾醇是植物油本身天然抗氧化成分[13]，能有效延缓脂质过氧化反应，抑制油脂酸值和过氧化值升高[14]，高瑀珑等[15]发现甾醇在大豆油中具有抗氧化作用且存在显著的量效关系；黄滢璋等[14]结果显示甾醇抗氧化作用明显优于 BHT 和 VC。李昌璞等[16]研究发现玉米油中甾醇浓度与羟自由基清除作用强度有明显量效关系。

本研究测定美藤果油中甾醇，初步探明美藤果油和核桃油甾醇不同，按美藤果油甾醇比例添加甾醇于核桃油中，以添加维生素E、柠檬酸、BHA、TBHQ的核桃油为对照组，采用 Schaal 烘箱法，研究美藤果油甾醇对核桃油氧化稳定性的影响，确定油脂中甾醇抗氧化作用以及其与天然抗氧化剂(维生素E、柠檬酸)协同增效作用，为研究天然复配抗氧化剂以及核桃油等油脂保存提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

美藤果仁：云南普洱；核桃：大理漾濞；豆甾醇和β-谷甾醇标准品(纯度≥98%)；甲醇、叔丁基甲醚：色谱纯；TBHQ、维生素E、BHA、柠檬酸均为食品添加剂。

1.2 仪器与设备

ThermoUltimate3 000高效液相色谱仪，RG-306游侠榨油机。

1.3 方法

1.3.1 美藤果油制备

美藤果果仁脱壳备用。准确取备用美藤果果仁5 kg，采用螺旋冷榨机压榨，离心过滤(3 500 r/min,10 min)处理美藤果毛油释出沉淀物，收集离心后的油液澄清无杂质呈淡黄色。

1.3.2 美藤果油中甾醇提取

参照高政等[17]、赵茜茜等[18]的方法。称混匀的美藤果毛油10 g(精确至0.01 g)，加入1 mol/L的氢氧化钠-乙醇溶液，加入适量沸石；水浴锅温度为85 ℃，冷凝回流煮沸1 h，用烧杯取适量蒸馏水，取几滴皂化液滴入蒸馏水中，看滴入的皂化液是否完全溶解没有油质，若完全溶解则说明皂化完全。皂化完全后减压蒸馏回收乙醇；加蒸馏水稀释，取出沸石，冷却皂化液备用。将乙醚加入皂化液，置于分液漏斗充分接触，静置分层，多次萃取，合并上层乙醚萃取液，依次用蒸馏水、氢氧化钠水溶液、蒸馏水洗涤，最后至乙醚溶液呈中性；再将乙醚溶液用无水硫酸钠多次过滤，减压蒸馏回收挥干乙醚，即得到美藤果油甾醇粉末粗提物。

1.3.3 美藤果油中甾醇的测定1.3.3.1 色谱条件

色谱柱为Syncronis-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相∶甲醇；波长∶205 nm；柱温∶30 ℃；进样量∶10 μL；流速: 1 mL/min。

1.3.3.2 标准品溶液配制

分别精确称取标准品豆甾醇、β-谷甾醇10 mg置于烧杯中，加叔丁基甲醚∶甲醇(1∶4)溶液溶解定容于5 mL容量瓶，即得浓度分别为2 mg/mL的豆甾醇和β-谷甾醇标准品储备液，混合得到浓度分别为1 mg/mL豆甾醇和β-谷甾醇，即混合标准品储备液。

1.3.3.3 标准曲线绘制

精确称取甾醇混合标准品储备液，加叔丁基甲醚∶甲醇(1∶4)稀释，豆甾醇和β-谷甾醇浓度分别为0.10、0.25、0.50、0.75、1.00 mg/mL混合线性标准品，摇匀溶液过0.22 μm微孔滤膜，置于样品瓶，以浓度为横坐标(x)，峰面积为纵坐标(y) 绘制标准曲线。

1.3.3.4 样品溶液配制

取10 g美藤果油经1.3.2提取得到甾醇粗提物0.10 g(精确至0.01 g)，置于10 mL的烧杯中，加入叔丁基甲醚∶甲醇(1∶4)溶液溶解，定容于10 mL容量瓶，摇匀溶液过0.22 μm微孔滤膜，置于样品瓶。

1.3.3.5 样品含量测定

将1.3.3.4样品溶液重复进样，通过混合甾醇标准品进行美藤果油甾醇定性，计算其峰面积平均值，用外标法计算美藤果油甾醇含量。

1.3.4 甾醇对核桃油氧化稳定性的影响

核桃油预处理：同前1.3.1步骤处理得到澄清现榨核桃油；将甾醇标准品按β-谷甾醇和豆甾醇比例为2∶1混匀备用。

参考田雨等[19]的方法。采用Schaal烘箱法,添加甾醇、用维生素E、TBHQ、BHA、柠檬酸作为对照，根据GB 2760—2014《食品添加剂使用标准》，添加量分别设置为100、150、200 mg/kg的核桃油样；同时不添加核桃油作为空白。将所有核桃油样于25 ℃超声处理10 min溶解混匀，放置温度为(60±1) ℃的恒温干燥箱，加快氧化，每隔12 h充分振荡混匀，并交换油样位置，每48 h测定核桃油的过氧化值和酸值。酸值按GB 5009.229—2016中指示剂滴定法；过氧化值按GB 5009.227—2016中滴定法。

1.3.5 复配甾醇抗氧化剂对核桃油抗氧化效果

将甾醇、维生素E和柠檬酸复配作为天然抗氧化剂添加到核桃油中，以过氧化值为响应值，采用BOX-Behnken设计响应面实验方案，根据GB 2760—2014《食品添加剂使用标准》，将甾醇、维生素E、柠檬酸添加量设为200 mg/kg。按方案添加核桃油样，通过恒温干燥箱温度为(60±1) ℃加速氧化10 d，测定所有核桃油样的过氧化值。

1.3.6 数据处理

所有实验数据均为至少3次测定的平均值，并计算标准偏差；相关性分析采用SPSS17.0 数据处理软件，差异显著(P<0.05)。

表1 响应面实验因素与水平

2 结果与分析

2.1 美藤果油中甾醇含量研究结果

2.1.1 美藤果油甾醇标准曲线的确定

根据图1叔丁基甲醇(1∶4)溶液HPLC色谱图与图2混合甾醇标品(1 mg/mL豆甾醇和1 mg/mLβ-谷甾醇)HPLC色谱图，结果显示，空白叔丁基甲醇溶液与混合甾醇标品，在同一保留时间无色谱峰，说明空白叔丁基甲醇(1∶4)溶液对美藤果油甾醇的含量测定无干扰。

图1 叔丁基甲醚∶甲醇(1∶4)溶液的HPLC色谱图

混合甾醇标品色谱图(图2)分析得知，豆甾醇标品出峰时间约在24 min左右，β-谷甾醇标品出峰时间约在28 min左右，分离较完整且峰形较好。根据豆甾醇和β-谷甾醇标品峰面积分别与浓度的关系建立标准曲线，得出在0.1～1 mg/mL范围内，线性回归方程：豆甾醇Y=97.809x-0.807 1，R2为0.999；β-谷甾醇Y=69.442x-0.111 2，R2为0.999。

图2 混合甾醇标品为1 mg/mL豆甾醇和1 mg/ml谷甾醇的HPLC色谱图

2.1.2 精密度结果

混合甾醇标准品样品(豆甾醇和β-谷甾醇质量浓度分别为1 mg/mL)经HPLC测定，得到峰面积结果(表2)，计算得知豆甾醇标准品RSD为0.28%，β-谷甾醇标准品RSD为0.70%，说明仪器精密度良好。

表2 精密度实验结果

2.1.3 加标回收率结果

美藤果油甾醇加标样品经HPLC测定，得到峰面积结果(表3、表4)，计算得知豆甾醇平均回收率为102.1%，RSD为0.71%；β-谷甾醇平均回收率为103.9%，RSD为0.56%；说明检测结果准确可靠。

表3 美藤果油样豆甾醇加标回收率结果

表4 美藤果油样谷甾醇加标回收率

2.1.4 美藤果油甾醇含量的确定

美藤果油甾醇粗提物样品HPLC色谱图(图3)，可知β-谷甾醇和豆甾醇是美藤果油甾醇的主要成分。美藤果油甾醇粗提物样品的豆甾醇出峰时间约在24.5 min左右；β-谷甾醇出峰时间约在28.2 min左右；与甾醇混合标品相比，出峰时间较相近，峰形变化不大，只是峰面积有所变化；计算美藤果油甾醇粗提物样品溶液的峰面积，其中豆甾醇峰面积为(66.430 1±0.45) mAU·min，β-谷甾醇峰面积为(108.542 5±0.32) mAU·min，得美藤果油中豆甾醇含量为(68.743 4±0.46) mg/100 g，β-谷甾醇含量为(156.466 8±0.46) mg/100 g。

图3 美藤果油甾醇粗提取物为0.1 g/10 mL样品的HPLC色谱图

2.2 甾醇对核桃油氧化稳定性影响结果

2.2.1 过氧化值的分析

随贮藏时间增加，核桃油样氧化酸败加大，核桃油样品过氧化值的量为1 kg核桃油样品中活性氧的毫摩尔数，过氧化值增大，说明核桃油被氧化程度加深。

2.2.1.1 不同添加量甾醇对核桃油过氧化值结果

由表5可看出，在核桃油中添加100、150、200 mg/kg甾醇，通过恒温干燥箱温度为(60±1)℃加速氧化12 d后，相当于常温20 ℃保存192 d,其中未添加甾醇的空白核桃油过氧化值增长最高为(56.43±5.17) mmol/kg。

表5 不同添加量的甾醇对核桃油过氧化值的影响

添加量100～200 mg/kg甾醇与空白核桃油过氧化值分析：第0～6天，过氧化值差异不显著(P>0.05)；第6～10天，过氧化值差异显著(P<0.05)；第12天，过氧化值差异不显著；添加量200 mg/kg甾醇与空白核桃油过氧化值分析：第0～4天，过氧化值差异不显著；第6～12天，过氧化值差异显著；根据GB 2760—2014《食品添加剂使用标准》，甾醇最佳添加量为200 mg/kg。

浓度为100～200 mg/kg甾醇对核桃油其抗氧化作用随着甾醇添加量的增大而增强；甾醇化合物对核桃油具有抗氧化作用的原因可能是因为甾醇通过直接与氧化产生的自由基反应，抑制脂质过氧化物的生成，以达到抗氧化作用[20]。

2.2.1.2 甾醇与不同抗氧化剂对核桃油过氧化值结果

从表6可看出，在添加量200 mg/kg的条件下，加速氧化后，未添加抗氧化剂的核桃油过氧化值增长最高；5种抗氧化剂对核桃油12 d后过氧化值高低依次为: TBHQ

表6 甾醇与不同抗氧化剂对核桃油过氧化值的影响/mmol/kg

添加甾醇和空白核桃油样过氧化值分析：第0～4天，差异不显著；经过4 d的引发诱导期，在第4～12天，差异显著(P<0.05)；说明甾醇能延缓核桃油氧化。可能是由于核桃油中甾醇含量较低，添加甾醇是脂溶性抗氧化剂并且补充核桃油甾醇内源性抗氧化成分含量，发挥其抗氧化能力。

添加甾醇和柠檬酸核桃油样过氧化值分析：第0天，差异不显著；第2天，添加柠檬酸比空白过氧化值高且差异显著，但甾醇和空白差异不显著，可能是由于核桃油自身抗氧化物质存在，添加柠檬酸反而起到促氧化情况，此时甾醇并未出现促氧化情况；第4～12天，差异显著，说明甾醇比柠檬酸抗氧化效果好； 添加甾醇和维生素E核桃油油样过氧化值分析：第0天，差异不显著；第2～12天，差异显著；说明维生素E在核桃油中未能发挥较好抗氧化能力，甾醇抗氧化能力较好；赵雁武等[21]研究以β-谷甾醇为主苹果籽油甾醇与维生素E对自由基清除能力，表明甾醇清除自由基的能力较维生素E高，本实验与此结果一致。

添加甾醇和TBHQ、BHA核桃油样，第0～12天，差异显著，说明添加甾醇抗氧化能力不如TBHQ和BHA；刘普等[22]发现几种天然抗氧化剂提高牡丹籽油氧化稳定性结果单独使用天然抗氧化剂效果弱于TBHQ研究，实验结果与此一致。

综上所述，在相同储藏时间、相同添加量时，5种抗氧化剂延缓核桃油氧化稳定性的顺序为:TBHQ>BHA>甾醇>维生素E、柠檬酸，与文献报道数据一致[23]。

2.2.2 酸值的分析

酸值是油脂中游离脂肪酸含量的标志，所有核桃油样品中的游离脂肪酸的含量增加，酸值变大，说明核桃油样品氧化程度越高。

2.2.2.1 不同添加量甾醇对核桃油酸值结果

由表7可看出，在核桃油中添加100、150、200 mg/kg甾醇，通过恒温干燥箱温度为(60±1) ℃加速氧化12 d后，未添加甾醇的空白核桃油酸值增长最高为(1.157±0.042) mg/g。

表7 不同添加量的甾醇对核桃油酸值结果/mg/g

添加量100～150 mg/kg甾醇与空白核桃油酸值分析：第0～4天，差异不显著(P>0.05)；第6天，差异显著(P<0.05)；第6～8天，差异不显著；第10～12天，差异显著；说明添加量100～200 mg/kg甾醇延缓核桃油氧化，但甾醇添加量较低，抗氧化效果未能12 d内均差异显著。添加量200 mg/kg甾醇与空白核桃油酸值分析：第0～4天，酸值差异不显著；第6～12天，酸值差异显著；与过氧化值分析结果一致。

添加甾醇为100～200 mg/kg的核桃油样酸值均低于空白核桃油，说明甾醇能够抑制游离脂肪酸的增长，对核桃油均有较强的抗氧化作用；不同添加量甾醇其抗氧化作用随着甾醇添加量的增大而增强；与过氧化值分析结果一致。

2.2.2.2 甾醇与不同抗氧化剂对核桃油酸值结果

由表8可看出，通过温度为(60±1) ℃加速氧化12 d后，空白核桃油样的酸值最高；添加量200 mg/kg的条件下，5种抗氧化剂添加核桃油样酸值高低依次为: 空白>柠檬酸、维生素E>甾醇>BHA>TBHQ。

表8 甾醇与不同抗氧化剂对核桃油酸值结果/mg/g

添加甾醇和柠檬酸核桃油样酸值分析：第0天，差异不显著，第2～12天，差异显著(P<0.05)，说明甾醇具有抗氧化性，且明显优于天然抗氧化剂柠檬酸，与过氧化值分析结果一致。

添加甾醇和维生素E核桃油样酸值分析：第0天，差异不显著，第2～12天，差异显著，说明甾醇抗氧化优于天然抗氧化剂维生素E，与过氧化值分析结果一致。

添加甾醇和TBHQ、BHA核桃油样，第0～12天，差异显著，说明添加甾醇抗氧化能力不如TBHQ、BHA，与过氧化值分析结果一致。

在相同储藏时间、相同添加量时，5种抗氧化剂延缓核桃油氧化稳定性的顺序为:TBHQ>BHA>甾醇>维生素E、柠檬酸。

2.2.3 甾醇与柠檬酸、维生素E复配研究结果

2.2.3.1 响应面回归模型方差分析

表9 响应面实验设计及结果

表10 回归模型方差分析结果

因此可用此回归模型分析和预测甾醇、柠檬酸和维生素E对核桃油过氧化值影响。结果显示，甾醇添加量的一次项A对过氧化值影响显著(P<0.05)，柠檬酸和维生素E添加量一次项B和C对过氧化值影响不显著(P>0.05)，此结果与过氧化值和酸值的研究结果一致。由图4可知，当维生素E添加量一定时，柠檬酸添加量在100～200 mg/kg范围内，核桃油过氧化值随着添加量的增大而平缓减小；甾醇添加量为100～200 mg/kg，核桃油过氧化值随添加量的增大而减小，说明甾醇对核桃油具有抗氧化作用，且随甾醇添加量的增加抗氧化能力增大；等高线结果说明甾醇与柠檬酸交互作用对核桃油过氧化值影响不显著。

图4 甾醇与柠檬酸交互作用对过氧化值影响的响应面图

由图5可知，当柠檬酸添加量一定时，维生素E添加量在100～200 mg/kg范围内，核桃油过氧化值随添加量的增大而平缓减小；甾醇添加量在100～200 mg/kg范围内，核桃油过氧化值随添加量的增大而减小。等高线结果说明甾醇与维生素E交互作用对核桃油过氧化值影响不显著。

图5 甾醇与维生素E交互作用对过氧化值影响的响应面图

由图6可知，当甾醇添加量一定时，柠檬酸添加量在100～200 mg/kg范围内，核桃油过氧化值也随添加量的增大而先平缓减小后平缓增大；维生素E添加量在100～200 mg/kg范围内，核桃油过氧化值随添加量的增大而先平缓减小后平缓增大。等高线结果说明柠檬酸与维生素E交互作用对核桃油过氧化值影响不显著。

图6 柠檬酸与维生素E交互作用对过氧化值影响的响应面图

2.2.3.2 验证试验

用模型分析可知，最佳复配组合是200 mg/kg甾醇、163.63 mg/kg柠檬酸、174.66 mg/kg维生素E，过氧化值预测值为14.36 mmol/kg。按最佳复配组合参数验证，过氧化值实验值为14.44 mmol/kg，实验值与预测值基本一致。通过表10和表6可知，复配组合过氧化值比美藤果油甾醇(29.87±1.98) mmol/kg过氧化值小，接近BHA的过氧化值(8.80±0.70)mmol/kg，说明复配组合对核桃油的抗氧化效果比添加单一甾醇好，和BHA抗氧化效果接近。研究表明，复配抗氧化剂可提高油脂氧化稳定性和品质，如茶多酚和维生素E等复配，提高棉籽油氧化稳定性[24]。

3 结论

将美藤果仁物理压榨得到美藤果油毛油，美藤果油中甾醇物质主要是β-谷甾醇和豆甾醇，豆甾醇含量为(68.74±0.46) mg/100 g，β-谷甾醇含量为(156.47±0.46) mg/100 g；美藤果油豆甾醇平均回收率为102.1%，RSD为0.71%；β-谷甾醇平均回收率为103.9%，RSD为0.56%。

当甾醇的添加量为200 mg/kg 对核桃油抗氧化效果最佳，与空白组差异显著(P<0.05)；与添加柠檬酸、维生素E核桃油样差异显著(P<0.05)；与添加TBHQ、 BHA核桃油样差异显著(P<0.05)；5种抗氧化剂对核桃油抗氧化作用效果依次为: TBHQ>BHA>甾醇>维生素E、柠檬酸。甾醇与柠檬酸、维生素E复配，最佳添加量配方为200 mg/kg甾醇、163.63 mg/kg柠檬酸、174.66 mg/kg维生素E，过氧化值为14.44 mmol/kg，复配组合过氧化值接近添加BHA(8.80±0.70)mmol/kg的过氧化值，说明甾醇及复配天然抗氧化剂对核桃油的氧化稳定性有一定抗氧化作用。

不同油脂的氧化稳定性不同可能与油脂中甾醇的种类及含量不同有关，甾醇对核桃油能在一定程度上抑制油脂氧化酸败，究其原因，甾醇是油脂中脂溶性天然抗氧化物质，加入核桃油中，补充核桃油甾醇内源性抗氧化成分，发挥抗氧化效果；因此甾醇是一种具有开发潜力的天然脂溶性抗氧化剂，但甾醇对油脂抗氧化机理有待进一步的研究。