祁 新，戴天浥,3，周丽免，赵红梅，洪文龙，田 洋,3 ，白忠彬

(1.云南农业大学 食品科学技术学院，云南 昆明 650201；2.国家辣木加工技术研发专业中心，云南 昆明 650201；3.云南省生物大数据重点实验室，云南 昆明 650201；4.云南斛哥药业有限公司，云南 普洱 665000)

目前，化疗是恶性肿瘤患者主要的治疗方式[1]，化疗药物一般以5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)最为常见。通常情况下化疗药物对机体正常细胞会造成极大损害[2]，化疗性肠道黏膜炎 (chemotherapy induced intestinal mucositis，CIM)是化疗患者最为常见的不良反应[3]，化疗引起的肠道黏膜炎达40%，而大剂量化疗患者的黏膜炎发生率高达76%[4]，其主要发生在小肠[5]。化疗引起的肠道黏膜炎表现为机体体质量减轻、肠道隐窝细胞凋亡和肠道屏障功能紊乱[6]。研究发现：CIM 与促炎因子水平升高有关，但其机制尚不清楚。CIM 不仅限制了抗肿瘤药物的临床应用，也严重影响患者的生活质量，导致病情恶化、危及生命[7]。因此，人们越加关注能够预防或治疗黏膜炎的药物研究。免疫调节剂如谷氨酰胺、精氨酸和益生菌对CIM 具有一定的预防和治疗作用[8]。但报道很少有传统中药材预防和治疗CIM，因此寻找一种安全、绿色的传统中药材是预防和治疗CIM 的重要研究方向。

铁皮石斛(Dendrobium officinaleKinura et-Migo，DOKM)是一种药食两用的传统中药材，被列为“中华九大仙草”之首[9]，主要功效成分有石斛多糖、石斛碱、芪类及其衍生物等。铁皮石斛具有广泛的药效作用，如抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、抗疲劳、降血糖、降血压、降血脂和增强免疫等功能[10]。前期研究[11]发现：铁皮石斛多糖具有肠道免疫调节功能，故笔者推测铁皮石斛多糖对化疗性肠道黏膜炎也具有防治作用。因此，本研究采用5-FU 诱导小鼠肠道黏膜炎模型，观察铁皮石斛粗多糖预防5-FU 引起的肠道黏膜炎的疗效，并对铁皮石斛粗多糖预防5-FU 引起的肠道黏膜炎进行初探，为铁皮石斛粗多糖预防化疗性肠道黏膜炎提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物

SPF 级雄性昆明鼠40 只，6～8 周龄，体质量20～25 g，购自辽宁长生生物技术股份有限公司，动物质量合格证号：211002300046930，许可证号SCXK (辽) 2015—0001。饲养环境：23～25 ℃，相对湿度60%～65%，光照12 h，自由进食和饮水。所有程序均严格按照中国实验动物使用和护理法规以及云南农业大学实验动物研究所制定的指南进行，并经云南农业大学动物保护和使用委员会批准。

1.1.2 药物

三年生林下仿生铁皮石斛茎(云南省普洱市斛哥庄园)；5-FU (CAS:5 1-21-8) (上海源叶生物科技有限公司)。

1.1.3 试剂

RNA 提取试剂盒、逆转录试剂盒和SYBR 染料(南京诺唯赞生物科技有限公司)；抗体PCNA(Abcam 公司)；引物白介素1β(interleukin1β，IL-1β)，肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα，TNF-α)、ZO-1 和Occludin (上海捷瑞生物工程有限公司)；免疫组化试剂盒(Vector 公司)。

1.1.4 仪器

LightCycler 480 II 荧光定量PCR 仪(德国Roche 公司)；光学生物显微镜(上海光学仪器厂)；组织包埋机、脱水机与切片机[赛默飞世尔科技(中国)有限公司]。

1.2 方法

1.2.1 铁皮石斛粗多糖的制备

铁皮石斛粗多糖的制备方法在林为艺等[12]和于静等[13]的基础上加以改进。将新鲜的铁皮石斛茎切割分段，每段长度0.5～1 cm，于60 ℃恒温烘3 d，将烘干的铁皮石斛粉碎成粉过100 目筛，备用。采用热水浸提法，取料液比(g∶mL)1∶10，浸提温度95～100 ℃，浸提时间为90 min，将提取液用六层纱布过滤，提取3 次，合并滤液，进行浓缩。4 000 r/min 离心15 min，加入5 倍体积95%乙醇，静置24 h，离心取沉淀，沉淀用适量无水乙醇洗涤2 次，冷冻干燥得到铁皮石斛粗多糖，于常温储存。铁皮石斛粗多糖的提取率为14.8%。

1.2.2 动物试验分组、给药与模型建立

昆明小鼠适应性喂养7 d 后，将小鼠按体质量随机分成正常组、CIM 模型组和铁皮石斛粗多糖低、中、高剂量组。正常组灌胃蒸馏水[0.01 mL/g (体质量)]，每日1 次，持续14 d，第15 天腹腔注射生理盐水[0.01 mL/g (体质量)]，每日1 次，持续2 d；CIM 模型组灌胃蒸馏水[0.01 mL/g (体质量)]，每日1 次，持续14 d，第15 天腹腔注射5-FU [130 g/kg (体质量)，溶于生理盐水]，每日1 次，持续2 d；铁皮石斛粗多糖低、中、高组灌胃铁皮石斛粗多糖(50、100、200 mg/kg，溶于蒸馏水)，每日1 次，持续14 d，第15 天腹腔注射5-FU [130 g/kg (体质量)，溶于生理盐水]，每日1 次，持续2 d。记录小鼠每日体质量，各组小鼠于腹腔注射结束48 h 后处死。

1.2.3 动物组织收集

颈椎脱臼处死小鼠，剖开腹腔进行组织收集，收集近盲端小肠段1 cm，用PBS 冲洗干净液氮速冻后于-80 ℃保存。收集近胃端小肠段1 cm，用PBS 冲洗干净放入4%多聚甲醛固定(4 ℃)。

1.2.4 小肠组织形态学观察

将放入4%多聚甲醛固定的小肠进行冲水3 h 后使用体积分数递增的酒精脱水，酒精体积分数依次为45%、55%、65%、75%、85%、95%和100%，二甲苯透明，石蜡包埋。对石蜡包埋块切片，厚度为5 μm，切片后再使用体积分数递减酒精水化，酒精体积分数依次为100%、95%、85%、75%和65%，洗后进行H E (hematoxylin andeosin)染色。电子显微镜下观察各组小鼠小肠组织形态学变化，并在100 倍下采集图片，在软件Image-pro plus 6.0 下进行测量。

1.2.5 小肠增殖蛋白免疫组化染色

石蜡包埋，切片厚度5 μm，在烘箱65 ℃烤片60 min，使用体积分数递减的酒精水化，采用柠檬酸钠进行抗原修复，加入10%过氧化氢室温下孵育30 min，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3 次，每次5 min，5%牛血清蛋白进行封闭，滴加PCNA 单克隆抗体4 ℃过夜。第2 天回收一抗，PBS 洗涤3 次，每次5 min，加入HRP 标记的PCNA 蛋白二抗，37 ℃孵育60 min，PBS 洗涤3 次，每次3 min，加入DAB 后，UP 水冲洗和苏木精复染1 min，脱水后进行封片，在烘箱65 ℃烤片60 min，在200 倍显微镜下进行观察并采集图像。

1.2.6 荧光定量PCR 法检测小肠屏障、炎症因子mRNA 表达水平

将-80 ℃冻存的小肠组织进行总RNA 提取，用分光光度计测定RNA 的含量。随后，使用逆转录试剂盒将RNA 逆转录为cDNA。采用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)法检测，采用SYBR Green Master (Rox) (Roche)按照表1 进行上机操作，每组试验重复3 次。试验中所用的引物序列见表2。

表1 RT-PCR 扩增条件Tab.1 RT-PCR amplification conditions

表2 RT-PCR 引物序列Tab.2 RT-PCR primer sequence

1.3 统计分析

试验数据采用GraphPad Prism 5.01 统计作图软件进行处理，组间比较采用单因素方差分析和独立t检验，“*”表示P＜0.05，差异显著；“**”表示P＜0.01，差异更为显著；“***”表示P＜0.001，差异极显著。

2 结果与分析

2.1 小鼠体质量变化

由图1 可知：0～14 d 铁皮石斛粗多糖不同剂量对小鼠体质量变化没有影响。腹腔注射5-FU后，与正常组比较，CIM 模型组小鼠体质量极显著下降(P＜0.001)。与CIM 模型比较，铁皮石斛粗多糖中剂量组明显逆转小鼠体质量的减轻(P＜0.05)，但是铁皮石斛粗多糖低剂量与高剂量组小鼠体质量变化没有显著性差异。这表明铁皮石斛粗多糖对化疗性肠道黏膜炎小鼠体质量减轻具有明显改善作用。

图1 铁皮石斛粗多糖对化疗性肠道黏膜炎小鼠体质量变化的影响)Fig.1 Effect of D.officinale polysaccharide on the body weight variation of mice with chemotherapy-induced intestinal mucositis

2.2 小鼠小肠组织形态学观察

由图2 可知：正常组小鼠小肠绒毛形态整齐规则，CIM 模型组绒毛形态萎缩、隐窝结构丧失，损伤较严重；铁皮石斛粗多糖中剂量组绒毛萎缩与隐窝结构缺失情况减少。

图2 各组小鼠小肠组织切片(HE 染色，×100))Fig.2 Histopathological features of small intestine tissues in mice (HE staining,×100)

由图3 可知：与正常组比较，CIM 模型组小肠绒毛长度极显著降低 (P＜0.001)、隐窝深度显著增加(P＜0.01)，绒毛长度/隐窝深度值极显著降低(P＜0.001)，这与文献[14]报道的黏膜炎组织形态学表现相符合，证明肠黏膜炎模型建立成功。与CIM 模型组比较，铁皮石斛粗多糖中剂量组小肠绒毛长度增加(P＜0.05)，隐窝深度值降低(P＜0.05)，小肠绒毛长度/隐窝深度比值升高(P＜0.05)，铁皮石斛粗多糖低、高剂量组组织形态学差异不显著。这表明铁皮石斛粗多糖对化疗性肠道黏膜炎小鼠小肠组织形态学具有明显改善作用。

图3 铁皮石斛粗多糖对小鼠小肠黏膜形态学参数的影响)Fig.3 Effects of D.officinale polysaccharides on the morphological parameters of small intestinal mucosa in mice

2.3 小鼠小肠PCNA 蛋白表达量的检测

由图4 可知：PCNA 阳性细胞被染成棕黄色；由图5 表明：与正常组比较，CIM 模型组小肠PCNA 蛋白表达量极显著降低(P＜0.001)；与CIM 模型组比较，铁皮石斛中剂量组小肠PCNA蛋白表达量显著增加(P＜0.05)，这表明铁皮石斛粗多糖可以促进化疗性肠道黏膜炎小鼠小肠上皮细胞增殖，具有缓解化疗性肠道黏膜炎的作用。

图4 各组小鼠小肠免疫组化组织切片(PCNA 染色，×200))Fig.4 Immunohistochemical tissue sections of mice small intestine in each group (PCNA staining,×200)

图5 铁皮石斛粗多糖对小鼠小肠PCNA 表达量的影响)Fig.5 Effect of D.officinale polysaccharide on PCNA expression in small intestine of mice

2.4 小鼠小肠ZO-1 和Occludin mRNA 表达量的检测

由图6 可知：与正常组比较，CIM 模型组的ZO-1与OccludinmRNA 表达量显著降低(P＜0.05 或P＜0.01)；与CIM 模型组比较，铁皮石斛粗多糖中剂量组OccludinmRNA 表达量显著增加(P＜0.05)，ZO-1mRNA 表达量差异不显著(P＞0.05)。这表明铁皮石斛粗多糖对化疗性肠道黏膜炎小鼠小肠屏障具有改善作用。

图6 铁皮石斛粗多糖对小鼠小肠肠道屏障mRNA 表达量的影响)Fig.6 Effect of D.officinale polysaccharides on the expression of intestinal barrier mRNA in mice

2.5 小鼠小肠IL-1β 和TNF-α mRNA 表达量的检测

由图7 可知：与正常组比较，CIM 模型组的IL-1β与TNF-αmRNA 表达量极显著增加(P＜0.001)；与CIM 模型组比较，铁皮石斛粗多糖中剂量组IL-1β与TNF-αmRNA 表达量显著降低(P＜0.05 或P＜0.01)。这表明铁皮石斛粗多糖抑制化疗性肠道黏膜炎小鼠小肠炎症因子的增加。

图7 铁皮石斛粗多糖对小鼠小肠炎症因子mRNA 表达量的影响)Fig.7 Effect of D.officinale polysaccharides on the expression of inflammatory factors mRNA in small intestine of mice

3 讨论

化疗药物具有一定程度的胃肠道毒副作用，化疗性药物以5-FU、伊立替康(CPT-11)和氨甲蝶呤(MTX)等最为常见。当机体受到化疗药物的治疗而产生肠黏膜炎时，肠黏膜结构受到破坏，肠屏障功能受损。

从本研究来看，CIM 模型组因使用5-FU后，小鼠体质量一直出现下降，而铁皮石斛粗多糖能显著逆转5-FU 引起的小鼠体质量下降。有研究表明：化疗引起的小鼠体质量下降可能与肠道组织无法对食物进行吸收和肠道微生物环境紊乱有关[15]。

小肠是消化和吸收的主要场所[16]。小肠绒毛上皮细胞将消化道中的氨基酸、葡萄糖和无机盐等吸收进血液，如果此部位受损，将影响上述营养物质的吸收，肠隐窝深度代表细胞的生成率，隐窝越浅细胞成熟度越好，分泌功能越好。绒毛缩短、隐窝深度增加、绒毛长度/隐窝深度比值下降都反映小肠黏膜损伤程度[17]。本研究CIM 模型组小鼠小肠绒毛明显萎缩、隐窝加深，表明动物模型建立成功。铁皮石斛粗多糖可以逆转小肠组织形态学变化，表明铁皮石斛粗多糖对化疗性肠道黏膜炎具有保护作用。

研究表明：化疗性肠道黏膜炎DNA 和非DNA 损伤都会导致上皮细胞增殖减少[18]。增殖细胞核抗原(PCNA)与细胞DNA 合成关系密切，PCNA 是反映细胞增殖状态的良好指标[19]。本研究应用免疫组织化学法，探讨铁皮石斛粗多糖对化疗性肠道黏膜炎肠上皮细胞增殖作用的影响，结果显示：铁皮石斛粗多糖可促进黏膜炎小鼠小肠上皮细胞 PCNA 表达，对肠道黏膜炎具有保护作用。

化疗性肠道黏膜炎会使肠上皮细胞极性失衡和肠屏障的通透性增大[20]，影响肠上皮结构和功能，导致毒性大分子物质进入体内，肠道屏障的完整性对调节肠道微生态有着重要的作用[21]。本研究表明：铁皮石斛粗多糖可增加小肠肠屏障mRNA 的表达，从而对肠道起到保护作用。

化疗性肠道黏膜炎会导致肠道发生炎性细胞浸润，产生组织炎症，从而导致组织损伤[22]。据相关报道表明：炎症因子(如IL-1β，TNF-α)是衡量肠道黏膜损伤严重程度和修复的重要指标[23]。结果发现：CIM 模型组IL-1β和TNF-αmRNA 表达量明显高于正常组，铁皮石斛粗多糖组IL-1β和TNF-αmRNA 表达量明显低于CIM 模型组。证实铁皮石斛粗多糖可以通过抑制炎症因子分泌来缓解小鼠化疗性肠道黏膜炎。

4 结论

铁皮石斛粗多糖通过减轻小肠组织损伤、促进小肠上皮细胞增殖、保护小肠肠道屏障和抑制炎症因子表达来缓解小鼠化疗性肠道黏膜炎。证明铁皮石斛粗多糖对化疗性肠道黏膜炎小鼠有较好的预防和保护作用，但其机制尚不清楚，有待进一步研究。