胡晓凤，王家福，尹忠良，康 斌，李建林，李少丽

(杭州佑本动物疫苗有限公司，浙江 杭州 310018)

支原体是一类没有细胞壁、高度多形性、能通过滤菌器且可用人工培养基培养增殖的原核生物，大小为0.1 μm～0.3 μm。细胞培养过程中污染支原体是常见问题，常见的支原体有口腔支原体、精氨酸支原体、猪鼻支原体和莱氏无胆甾原体(Acholeplasma Laidlawii)，有的细胞株可同时污染两种以上支原体。当特别重要的细胞株或病毒污染支原体时，要对其清除，最常用且最简便的方法是用抗生素处理。

本研究拟清除猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，PRRSV)中污染的支原体，旨在保证病毒的纯净性。研究在Mar145细胞培养液中加入支原体清除剂，优化细胞耐受该试剂的工作浓度，在加入清除剂的细胞培养液中接种PRRSV，盲传6代后进行支原体PCR检测，电泳显示支原体阴性，表明PRRSV中污染的支原体得到了彻底清除。

1 试验材料

PRRSV及Marc145细胞(杭州佑本动物疫苗有限公司CNAS检测中心提供)；支原体清除剂(上海碧云天生物技术有限公司)；支原体PCR检测试剂盒(哈尔滨世纪元亨生物科技公司)；0.1 μm滤菌器(美国Millipore公司)；细胞培养瓶及培养板(美国Corning公司)；DMEM培养基(美国GIBCO公司)；胎牛血清(美国GIBCO公司)。

2 试验方法

2.1 Marc145细胞耐受支原体清除剂工作浓度的优化

用含5%胎牛血清的DMEM培养液在6孔板中培养Marc145细胞，分别加入终浓度为10 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL的支原体清除剂，同时设Marc145细胞空白对照孔，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。按照此方法盲传3代，根据Marc145细胞的生长状态确定支原体清除剂的最适工作浓度。

2.2 PRRSV中支原体的清除

在Marc145单层细胞培养液中按照培养液体积3%～5%的比例接种PRRSV，吸附1 h，然后加入25 μg/mL的支原体清除剂，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。盲传3代，不加支原体清除剂继续盲传3代，按照支原体PCR检测试剂盒说明书进行支原体PCR检测。

2.3 PRRSV的病毒效价测定

将最后一代盲传的PRRSV以及清除前的PRRSV分别接种96孔板，按照Reed和Muench法进行病毒效价测定。

3 试验结果

3.1 Marc145细胞耐受支原体清除剂工作浓度的优化结果

在Marc145细胞培养液中加入终浓度为12.5 μg/mL、25 μg/mL、37.5 μg/mL的支原体清除剂，培养3代后显微镜观察，可见所有孔中Marc145细胞状态正常，且各孔之间无明显差异，确定Marc145细胞耐受支原体清除剂的工作浓度范围为12.5 μg/mL～37.5 μg/mL，考虑支原体清除剂浓度太大对细胞可能造成不易观察的细微病变，最终，将其最适浓度确定为25 μg/mL(图1)。

3.2 PRRSV中支原体的清除试验结果

将支原体清除剂按照终浓度25 μg/mL加入PRRSV培养液，盲传3代，48 h～52 h后细胞出现明显的聚堆、脱落等病变。然后不加支原体清除剂再盲传3代，最后对用支原体清除剂清除的F3代PRRSV及之后盲传的3代(F4～F6)PRRSV进行支原体PCR检测，电泳结果显示，所有检测PRRSV样品未在602 bp处出现特异性条带，表明PRRSV中支原体彻底清除(图2)。

3.3 PRRSV的病毒效价检测结果

按照Reed和Muench法检测PRRSV清除前、后的病毒效价分别为107.3TCID50/mL和107.5TCID50/mL。将支原体完全清除的PRRSV做好标记，-80 ℃冻存。

4 讨论

支原体广泛存在于我们生活的环境中，一般不致病，但若在细胞培养时或者病毒分离过程中污染了支原体，则会影响细胞生长状态或病毒效价，此时需要对支原体进行清除。不同细胞对支原体清除剂的耐受浓度不同，支原体清除剂浓度太大会阻碍细胞生长，甚至影响细胞状态，而浓度太小又起不到抑制或清除效果。本试验首先优化了Marc145细胞耐受支原体清除剂的最佳工作浓度，确定细胞可以在终浓度为12.5 μg/mL～37.5 μg/mL的细胞培养液中生长，考虑支原体清除剂浓度太大对细胞可能造成不易观察到的细微病变，最终，将其最适浓度确定为25 μg/mL。另外，加入支原体清除剂或其他清除试剂后病毒至少要正常培养3代才可以检测，以便更客观评价支原体的清除效果。

采用商品化的抗生素清除支原体时，当支原体含量较高时需要加大抗生素用量或多清除几代，有时还需要使用0.1 μm滤菌器过滤以降低支原体含量。此外，支原体清除剂属于抗生素，若长期使用一种抗生素可能会使支原体产生耐药性，建议不同类清除剂交替使用。