高 璐， 黄瑞华， 张盛春

(华南师范大学生命科学学院∥广东省植物发育生物工程重点实验室， 广州 510631)

BLISTER蛋白(BLI)共有714个氨基酸，其C末端在植物中高度保守，不同物种中具有高度序列相似性；第354至第527氨基酸区域序列与细菌中染色体结构维持蛋白的SMC结构域有一定相似性，故被称为类SMC蛋白结构域. SMC蛋白质参与了染色质生物学的各种过程，包括染色体浓缩和DNA修复[1]；N末端蛋白序列为核定位和输出信号以及细胞周期蛋白结合基序[2]. 缺失BLI可导致植物发育异常，其种子、叶和花的发育均受到影响，植株个体较小. 相比于同时期野生型植株，bli突变体植株种子表现出萌发延迟的现象，部分表皮细胞变为愈伤组织. 萌发后，叶片出现严重的发育缺陷，细胞大小和形状不规则，粘附性降低. 在生殖生长时期，其花粉育性低，后代种子皱缩[2]. 研究[2]表明：BLI中C端类SMC蛋白结构域与CLF蛋白中CXC结构域有相互作用. 通过对bli突变体植株的转录分析，发现大量的脱落酸信号通路及许多应激反应相关基因的表达上调，这些基因的差异性表达表明BLI作为拟南芥应激反应基因的关键调控因子抑制了脱落酸信号反应的靶基因，参与了植物对寒冷及干旱等多种胁迫的响应[3]. 除此之外，研究发现BLI蛋白是双功能蛋白激酶/核糖核酸酶蛋白IRE1的负调控因子，通过直接或间接调控其他未知蛋白来抑制IRE1在营养生长过程中的功能，从而保证拟南芥植株的正常生长. IRE1是参与蛋白质量监控，折叠反应UPR基因调控的因子，即当细胞内折叠蛋白或错误折叠的蛋白在内质网中过多积累时，通过使蛋白质折叠和降解能力与蛋白质折叠需求相一致来减轻内质网中折叠蛋白的负荷[4]. 然而，正常生长条件下, UPR通路的过度激活会影响植物的生长发育.BLI的突变导致UPR基因表达上调，激活的IRE1会诱导UPR基因和其他非典型内质网应激基因，导致植物生长迟缓以及细胞死亡[5].

植物虽然存在有分生组织，并且能够利用自身组织实现营养物质再利用从而处于不断更新的状态, 但其仍随着年龄增长而逐渐衰老[6]. 植物衰老是植物发育的最终阶段[7], 通过体内大分子的协同降解, 将成分转移至植物生殖器官并最终转移至种子, 从而实现世代延续, 是一个复杂精妙、高度调控的年龄依赖性发育退化型过程[8]. 植物衰老引发的细胞死亡受植物年龄及其他内外环境因素影响, 是一种主动的遗传学调控的细胞程序性死亡过程. 研究[9]认为, 细胞程序性死亡(PCD)是一种由相关因素影响诱发从而通过主动的遗传调控介导的细胞自杀式过程. 目前已鉴定出许多衰老相关基因(SAGs), 超过800种基因被归至SAGs衰老基因家族，超过400个转录因子在衰老相关转录调控网络中发挥作用[10]. 此领域学者的主要研究目标为发现和分析各种衰老相关因子，如信号转导相关蛋白和转录因子在衰老过程中的功能和调控机制, 以解析植物衰老相关的分子调控网络. 拟南芥突变体bli植株在整个发育过程中表现出的叶片衰老表型可作为研究植物衰老的一个良好实验材料.

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

野生型拟南芥Col-0；突变体bli(T-DNA插入突变体, Locus: AT3G23980)；BLI互补植株COM-1；BLI过表达植株OE-1；BLI启动子表达模式分析植株pBLI∷GUS.

1.2 实验方法

1.2.1 叶绿素含量测定 快速称取每种材料0.1 g并置于2 mL EP管中，迅速向管中加入预冷后的80% 丙酮研磨，磨后转移至10 mL 试管中，加入预冷后的80% 丙酮至10 mL，扣紧盖子后用锡纸密封整支试管，放于4 ℃冰箱浸提24 h. 浸提后收集上清液即为叶绿素提取液.

1.2.2 离子渗透率测定 称取每种材料0.1 g，超纯水漂洗3次以除去表面电解质. 将叶片擦干后用剪刀剪碎，放入加有10 mL超纯水中的50 mL锥形瓶中，紧密封口后置于25 ℃的摇床中以180 r/min振荡3 h；取出后利用纯水电导率仪测定电导率C1；测定之后重新紧密封口，沸水浴20 min；冷却至室温后测定电导率C2；测量超纯水的电导率为C0；计算相对电导率：η=(C1-C0)/(C2-C0)×100%.

1.2.3 ROS诱导实验 配制20 mmol/L的过氧化氢溶液，按时间梯度喷洒培养基中7日龄大小的野生型Col- 0植株，计时，按点迅速取出并于液氮中速冻，全部实验组完成后提取RNA，并进行后续实验以检测BLI表达量变化.

1.2.4 DAB、NBT染色 将实验材料浸入装有染色液的10 mL试管中，用锡纸将整支试管包装好，于室温条件下静置12 h；将染好色的叶片置于75%乙醇中脱色，脱色后展开叶片，观察拍照.

1.2.5 GUS染色 将相关实验材料浸泡于装有GUS染色液的试管中，抽真空10 min；用锡纸将整支试管包好后置于37 ℃恒温培养箱，孵育一定时间后查看染上颜色即可取出.

1.2.6 RT-PCR基因表达量检测

(1) 拟南芥总RNA的提取. 取实验材料100 mg，液氮速冻，于1.5 mL EP管中加入1 mL Trizol试剂，放置冰上；将叶片于液氮预冷后的研钵中迅速研磨至粉末状，移入有Trizol的EP管中，漩涡振荡60 s，放置冰上；室温静置7 min，4 ℃、12 000 r/min 离心10 min，小心吸取上清液至新的1.5 mL EP管中；加入200 μL的氯仿，立即剧烈振荡20 s后室温静置3 min；4 ℃、12 000 r/min 离心15 min，取上清液至新的EP管中，此时RNA存在于上层水相中；加入等体积异丙醇，颠倒混匀后，室温放置10 min；4 ℃、12 000 r/min 离心10 min，离心管底部可见白色沉淀，弃上清；加入1 mL 75% 乙醇(用DEPC处理过的无菌水配制)，洗涤沉淀；4 ℃、8 000 r/min 离心5 min，弃上清液后放置浓缩干燥仪风干残余的酒精；加入30 μL的无菌水，60 ℃水浴10 min溶解RNA；分光光度计检测其纯度和浓度.

(2)反转录生成cDNA. 在冰上将反应液各组分混合，用移液器吹打至均匀；将样品置于65 ℃反应5 min，之后立即置于冰上反应2 min；在冰上将反转录体系反应液各组分混合，加入上述样品中，用移液器吹打至均匀；将样品置于42 ℃反应90 min，再置于72 ℃反应15 min.

(3)实时荧光定量PCR. 设计相关基因引物(表1)；配制样品反应体系，反应结束后分析扩增曲线、溶解曲线及Cq值判定实验结果是否可信，荧光定量PCR实验均重复3次，每次3个重复. 所用仪器为Bio-RAD公司7500 Fast Real-Time PCR system. 参考基因为ACTIN.

表1 引物对及序列Table 1 Primer pairs and sequences

1.3 本实验中采用的引物对

2 实验结果

2.1 突变体bli植株叶片表型分析

植物衰老是植物发育的最后阶段. 在此阶段中，叶绿素分解相关基因表达上调，光合色素如叶绿素、叶黄素及类胡萝卜素的降解速率加快，植物叶片在形态上表现出黄化现象，是植物衰老的形态学标志之一，因此观察叶片黄化是一个直观检测叶片衰老的方法[10]. 正常情况下拟南芥在开花后莲座叶逐渐出现黄化，但是部分bli突变体在培养基生长时期即出现黄色，不能正常生长，最终在培养基中衰老死亡. 比较同时期野生型Col-0植株，突变体bli在初期发育阶段存活率低，可以继续完成生长发育的植株整体矮小，且在4周龄时叶片开始黄化(图1A). 而BLI互补植株COM-1中表型恢复正常，说明突变体bli植株的早衰表型确实是由于缺失BLI导致. 与此同时，与野生型Col-0相比，BLI过表达植株OE-1并未观察到其他明显表型(图1B)，表明BLI基因并不存在剂量效应.

图1 不同BLI基因型植株的叶片表型

2.2 突变体bli植株叶绿素含量及离子渗透率检测

叶片黄化主要是因为植物细胞生理生化发生改变所引起的. 在叶片衰老初期，伴随着叶绿体的降解，细胞内叶绿素含量不断下降，衰老后期液泡膜等进一步裂解导致胞内离子渗漏，细胞导电性升高. 因此，通过定量测定叶片中叶绿素含量、离子渗透率可以进一步验证观察到的衰老表型[10]. 针对本实验中突变体bli植株表现出来的早衰现象，选取长势较好的bli植株, 在其出现黄化叶片(约4周龄)的前后时间点检测其叶绿素含量及离子渗透率, 并以相同时期相同培养条件下的野生型Col-0、BLI互补植株COM-1和BLI过表达植株OE-1作为对照. 结果(图2)发现：bli植株在3周龄与其他植株比较，差异无统计学意义，5周龄时出现叶绿素含量远远低于其他植株，离子渗透率高于其他植株的现象. 以上结果进一步验证了BLI缺失导致植株出现衰老表型.

图2 不同BLI基因型叶绿素相对含量及离子渗透率

2.3 BLI表达模式分析

图1、2表明突变体bli植株出现早衰表型，为了解析其相关的分子机制，对BLI的表达模式进行了检测. 通过对10日龄的pBLI∷GUS植株进行GUS组织化学显色，并于显微镜下观察，结果发现BLI在幼苗的根、子叶等各种组织器官中均表达，并且根部颜色较深(图3A). 为进一步探究其在植株中不同组织的表达模式，提取同一批野生型Col-0植株种子、根、叶片、花、茎和荚果等不同组织器官中的RNA，再通过反转录、实时荧光定量PCR技术检测了BLI的表达量(图3B). 结果发现：BLI在各组织中均有表达，并且在荚果和根中的表达量最高.

图3 BLI基因的组织表达模式分析

2.4 BLI基因与ROS的关系分析

植物的衰老往往伴随着活性氧(ROS)的增加以及过氧化物酶活性的降低. 通过外源施加H2O2可降低叶片中超氧阴离子、丙二醛、抗坏血酸含量并增加谷胱甘肽、类黄酮含量，提高超氧化物歧化酶以及抗坏血酸过氧化物酶活性[10-11]. 为明确BLI蛋白和ROS之间的关系，通过外源施加H2O2检测野生型植株BLI表达情况. 结果表明：20 mmol/L H2O2处理7日龄Col-0幼苗后，随着处理时间的增加，BLI表达量逐步降低，在处理2 h后达到最低，为处理前的33.3%，之后无显著变化(图4A). 表明外源ROS能够抑制BLI基因的表达. 同时利用DAB(检测H2O2)和NBT(检测超氧阴离子)染色检测了5周龄Col-0 和bli植株第5片叶片中ROS的含量，结果发现bli突变体叶片中出现明显的黄褐色(图4B)和深蓝色沉淀积累(图4C)，表明突变体bli植物叶片中积累了较多的ROS. 以上结果表明BLI蛋白可能参与ROS介导的植物衰老过程.

图4 BLI与ROS的关系分析

2.5 突变体bli植株衰老相关基因表达分析

为进一步探究BLI蛋白参与调控植物衰老的分子机制，分析了5周龄幼苗体内衰老相关基因的表达情况.SAGs衰老基因家族中SAG12在叶片衰老后开始表达，并且其表达量随衰老的加剧而增加; 另外SAG13、SAG101与衰老过程密切相关[10]. 结果显示:在突变体bli植株中，衰老相关基因SAG12、SAG13和SAG101的表达显著高于野生型植株，但是互补和过表达植株中SAGs表达与Col-0相比并无明显差异(图5A)，表明bli突变体提前进入衰老阶段. 在叶片衰老过程中,分解代谢逐渐取代合成代谢，同化物积累减少，光合作用中相关基因CAB1及LHCA1、蛋白质合成相关基因RBCS表达下调[10]. 结果发现，与野生型植物相比，bli植株中光合作用相关基因LHCA1、RBCS和CAB1的表达明显降低(图5B)，该结果与叶片衰老生理生化变化特征一致. 以上结果表明BLI蛋白参与植物衰老过程，为解析其调控衰老的分子机制奠定了基础.

图5 BLI植株衰老相关基因表达分析

3 讨论

植物衰老是复杂精细且受严格调控的植物发育阶段，是植物个体对内源性发育以及外部环境信号的综合反应. 植物通过协调细胞、组织、器官及组织水平上的各种稳态，实现营养物质从叶片转移至种子. 研究表明植物衰老受到多种正、负调节基因的调控. 迄今为止，已发现许多与衰老过程密切相关的基因，其中大多数基因被归至SAGs基因家族. 目前也发现了不同家族的转录因子如WRKY、NAC等，是植物衰老的正调控因子[10].

植物衰老过程中伴随着植物细胞结构及生理生化特征的改变. 结构改变的显著特征是细胞内物质及细胞器的有序降解；生理生化变化首先表现为细胞内同化作用的下降，蛋白质、DNA、RNA等生物大分子的分解代谢逐渐取代合成代谢，含量不断减少，与此相关的降解酶活性增强；生物膜解体导致膜内离子渗漏从而使细胞离子渗透率升高，叶绿素的降解导致植物光合速率不断下降，超氧阴离子、H2O2等活性氧(ROS)的含量进一步增加，细胞内环境稳态遭到破坏，这些变化导致植物个体命运走向终结[12]. 与野生型拟南芥植物相比，bli突变体叶绿素含量显著下降，细胞离子渗透率显著升高，DAB、NBT染色结果表明其体内活性氧含量显著升高，因此，bli突变体植株提前进入衰老阶段. 在衰老过程中，植株体内与蛋白质、核酸、糖类等生物大分子降解相关的基因以及衰老相关基因如SAG101等的表达在bli突变体中上调，而与光合作用、同化作用等合成代谢相关基因如LHCA1的表达则下调. 生理生化及分子生物学研究结果表明BLI确实参与了植物叶片衰老的调控，并且BLI可能是衰老的正调控因子.

已有研究结果发现：植物受到胁迫时，其基因表达模式与植物衰老时基因表达模式密切相关，如水杨酸(SA)介导的植物衰老途径与植物自然衰老途径过程高度重叠. 近年来对脱落酸(ABA)、茉莉酸(JA)、乙烯及水杨酸(SA)等内源激素的研究发现，其广泛参与植物个体对各种非生物以及生物胁迫的响应，逐渐发现较多参与环境变化响应的基因也调控植物衰老[13]，胁迫诱导表达的基因也是衰老过程中被调控表达的基因，细胞分裂素的受体AHK3介导的ARR2磷酸化是调控细胞寿命的关键因子, 茉莉酸(JA)及茉莉酸甲酯(Me JA)可诱导植物衰老相关基因如SEN4、SEN5的表达，AtNAP转录因子通过直接诱导靶基因SAG113介导ABA诱导的叶片衰老等，已有的研究结果表明生物或非生物胁迫通过影响植物激素的合成进而激发了共同参与胁迫与衰老响应基因的表达，最终诱发植物衰老. 除此之外，蛋白质泛素化降解过程也参与控制植物衰老，如酰基水解酶通过破坏细胞膜的完整性、转化酶在细胞凋亡中发挥作用; 并且依赖于溶酶体和液泡的蛋白质降解途径即自噬(植物体在受到胁迫时由于营养物质的缺乏，通过对体内大分子的降解得到N源和C源以维持植物体的生物合成并促进植物体内物质的再利用)过程也与衰老过程密切相关[14]. 鉴于目前研究发现BLI蛋白作为多种应激反应的调节因子参与了植物对环境的适应性，因此可进一步可探究拟南芥bli突变体与细胞自噬及水杨酸信号途径介导的细胞衰老分子调控机制，以解析其在植物衰老分子调控网络中的作用机制.

4 结论

相较于野生型Col-0植株，bli突变体植株中ROS含量升高，表现出早衰现象；叶片黄化时间出现较早，在幼苗时期体内叶绿素含量下降，离子渗透率升高，衰老相关基因表达上调，光合作用相关基因表达下调；基因表达分析表明其在种子及根部中表达量较高，施加外源活性氧可降低BLI表达量. 本研究结果初步证明BLI参与植物衰老过程，但其分子调控网络仍需进一步的探究.