隋新莹，刘国利，董春海

（1.青岛农业大学生命科学学院，山东 青岛 266109；2.无棣县小泊头镇农业综合服务中心，山东 无棣 251911）

铁是植物生长所必需的微量元素之一［1］，多位于叶绿体内，参与叶绿素的合成、细胞内的氧化还原反应、呼吸作用、生物固氮、酶促反应等重要生理过程［2］。铁更是人体所必需的微量元素之一［3］，是人体血红蛋白、肌红蛋白的重要组成成分，能运输O2和CO2，也是过氧化氢酶和过氧化物酶的重要组成成分［4］。人体缺铁会患缺铁性贫血，从而引发营养不良、免疫力下降、生长发育迟缓、智力低下等病症［5］，影响人们身体和心理的健康。据报道，缺铁性贫血已成为仅次于结核病的全球患病率最高、耗资最大的公共卫生问题［6］，在一定程度上阻碍社会经济的发展。

治疗缺铁性贫血主要通过服用铁营养素补充剂、调整饮食结构、食物强化以及生物强化等。其中，服用铁营养素补充剂的方法见效快，但经济成本高且副反应比较多［7］；调整饮食结构的方法在我国生活贫困家庭中将无法实现，且见效慢［8］；食物强化的方法简单、有效，但成本也较高，且社会认同度低。相比较而言，生物强化，即通过育种手段提高现有农作物籽粒中微量营养元素铁的含量，不仅具有生产简单、易于接受的特点，而且食用方便、经济实惠，是防止和改善人体铁元素缺乏最经济、最安全和最有效的方法之一［9］。目前，国内外科技工作者已经认识到利用农作物提高铁营养的重要性，但有关铁强化作物的育种研究较少，市场缺乏优质的铁营养种植品种。

小麦是最重要的主粮作物之一，全球约1／3的人口依赖小麦提供基本的营养需求。在全球人口日益增长的大环境下，利用现代育种手段提高小麦产量、提升其营养价值，无论对缓解人类营养需求的压力还是保障我国粮食安全都具有极其重要的意义。前期研究中，我们利用化学诱变剂甲基磺酸乙酯（EMS）对小麦主栽品种鲁原502进行诱变，并在盐碱地高通量筛选获得了耐盐、高产新品系［10］。在此基础上，又从耐盐、高产新品系中筛选获得了富铁小麦新材料，并对与铁元素吸收、运输相关的关键基因表达进行了分析。这对于人们深入了解小麦中铁营养元素的分子调控以及培育有益于人体健康的铁营养强化作物都具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

小麦耐盐、高产突变体材料来自于前期研究中利用化学诱变剂甲基磺酸乙酯（EMS）对鲁原502进行诱变获得的M3～M5代单株系［11］。小麦诱变及盐碱地自然筛选于2016—2020年分别在山东省东营市利津县毛坨村和滨州市无棣县小泊头镇郭马村试验田进行。

1.2 测定项目及方法

1.2.1 小麦突变体幼苗根系的铁敏感性分析 挑选籽粒饱满的小麦种子于50 mL离心管中，加入40 mL去离子水和10 mL次氯酸钠（去离子水∶次氯酸钠＝4∶1），再加入15μL Triton X－100，于200～250 r／min摇床上振荡15 min，重复两次；再换成去离子水，清洗3次。将清洗完的种子置于4℃冰箱浸种过夜。然后将种子摆放在铺有两层滤纸的培养皿内，加入10 mL EDTA－Fe溶液，置于25℃培养箱中培养36 h后观察并记录小麦幼苗的最长根生长。

1.2.2 小麦突变体籽粒铁元素含量分析 将洗净的种子于65℃烘箱中烘干，然后于粉碎机中充分粉碎，过1 mm筛。称量1.0000 g粉碎好的样品于消解管中，加入10 mL HNO3和2 mL HClO4，静置过夜；在160℃的消解仪上加热消解至溶液澄清透明且只剩1 mL左右，再加入10 mL去离子水，继续加热除酸后趁热转移至25 mL容量瓶中，混匀后静置过夜。采用ICP－OES电感耦合等离子体发射光谱仪对铁元素含量进行测定。

1.2.3 小麦突变体幼苗铁相关基因的表达分析 将洗净、浸泡好的种子摆放在铺有两层滤纸的培养皿内，加入10 mL去离子水，置于25℃、16 h光照／8 h黑暗培养箱中培养3 d后，用镊子将其胚乳去除，再在1／5Hoagland营养液（无微量元素）中培养7 d，然后将培养液换成EDTA－Fe溶液（1.5 mmol／L），分别处理0、3、6、12、24 h后取材，用于RNA 提取。利用TIANGEN 公司的TRNzol Universal试剂盒进行总RNA的提取。利用诺唯赞HiScriptⅢAll－in－one RT SuperMix Perfect for qPCR 试剂盒进行gDNA 的合成。qRT－PCR分析采用诺唯赞公司的ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒，所用引物由青岛擎科公司合成。

1.3 数据统计分析

用WPS软件进行数据处理和作图，用LSD法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 小麦耐盐突变体的铁敏感性分析

前期研究中，我们利用EMS对小麦鲁原502进行遗传诱变，经过盐碱地自然筛选获得了约2 000个株系［10］。进一步利用150 mmol／L NaCl胁迫处理筛选出430个耐盐性强的株系。将这些耐盐株系以等量种子（150 g）在同等面积（约20 m2）的盐碱地上进行模块式种植，分别在2018、2019、2020年统计分析M3、M4、M5代的产量，筛选获得了11个耐盐小麦新品系，产量平均增幅在2.46%～31.52%。

为了分析这些耐盐小麦突变体的铁敏感性，我们先将野生型（WT）对照材料（鲁原502）的种子置于不同浓度的EDTA－Fe溶液培养36 h，观察比较幼苗根系对铁的敏感性，结果发现幼苗的最长根长随铁浓度增大先增加后减小，在EDTA－Fe浓度为1.5 mmol／L时达最大值，所以本试验选择1.5 mmol／L为铁敏感性的EDTA－Fe筛选浓度。

通过观察外源铁（1.5 mmol／L EDTA－Fe）处理对11个耐盐小麦突变体幼苗最长根生长的影响（图1 A），发现两个突变体（LY 1－29和LY 2－7）的幼苗最长根长明显大于野生型，而其它突变体幼苗的最长根长与野生型相近。进一步利用不同浓度的EDTA－Fe（0、0.5、1.5、3.0、4.5 mmol／L）对这两个突变体进行处理，结果（图1 B）表明，野生型（鲁原502）和两个突变体（LY 1－29和LY 2－7）的幼苗最长根长均在EDTAFe浓度为1.5 mmol／L时达到最大值；在高浓度EDTA－Fe（1.5、3.0、4.5mmol／L）处理下，两个突变体（LY 1－29和LY 2－7）的幼苗最长根长均极显著大于野生型对照（P＜0.01）。

图1 小麦耐盐突变体幼苗根系的铁敏感性分析

2.2 小麦耐盐突变体的籽粒铁含量测定

为了深入了解小麦耐盐突变体的铁敏感性改变是否与内源铁元素含量有关，选取两个铁敏感性显著降低的突变体（LY 1－29和LY 2－7）进行铁含量测定。结果（图2）显示，两个突变体籽粒的铁含量显著高于野生型，其中，LY 1－29的籽粒铁含量为80.00 mg／kg，比野生型的高126%；LY 2－7的籽粒铁含量为76.39 mg／kg，比野生型的高115%。

图2 小麦籽粒铁含量测定

2.3 小麦耐盐突变体中铁相关基因的表达分析

小麦耐盐突变体中铁含量的增加可能与铁吸收及转运相关基因的表达密切相关。为了解两个突变体（LY 1－29和LY 2－7）中铁含量增高的分子基础，选取小麦中与铁吸收、转运相关的基因进行表达水平测定，包括TaYSL1（yellow stripe like，登录号：TraesCS2B01G407900）、TaFIBP（ferric ion binding protein，登录号：TraesCS1A01G019900）、TaIITT（iron transmembrane transporter，登录号：TraesCS4B01－G219000）、TaRTH（RTE1－homolog，登录号：TraesCS5A02G445300）、TaZIP29［11］（zinc－regulated transporters and iron－regulated transporterlike protein，登录号：TraesCS6D02G153800）。

qRT－PCR分析结果表明，这5个与铁吸收、转运相关的基因在野生型和突变体中的表达模式各不相同，但均在铁溶液处理的一定时间后呈现高水平表达（图3）。值得特别关注的是，LY 1－29、LY 2－7两个突变体中，这5个与铁吸收、转运相关的基因表达量在铁溶液处理后均不同程度地高于野生型对照。

图3 EDTA－Fe处理下小麦富铁突变体中铁吸收、转运相关基因的表达分析

3 讨论与结论

我国可耕地面积小，土地盐渍化较为严重，导致农作物产量和营养价值降低。

甲基磺酸乙酯（EMS）是一种温和的化学诱变剂，其诱变产生的点突变频率高、染色体畸变少、破坏性小，且诱变具有随机性，可获得丰富的遗传材料，在遗传育种中广泛应用。在小麦中，如张维宏等［12］利用EMS诱变获得6个叶锈病敏感型突变体；薛芳等［13］利用EMS诱变获得7个抗性淀粉含量高的突变体；Zhang等［14］利用EMS诱变获得晚抽穗突变体；赵天祥等［15］利用EMS诱变获得特矮变异突变体。但EMS诱变在耐盐小麦研究中应用还较少。我们在前期研究中利用EMS诱变小麦栽培品种鲁原502，经盐碱地自然筛选和高盐（150 mmol／L）筛选，获得了耐盐、高产突变体株系［10］，为深入研究小麦耐盐机制提供了新种质。

研究表明，小麦等禾本科单子叶植物吸收、转运铁元素的过程可分三步，首先缺铁信号使植物根系向土壤中分泌一种可以与三价铁螯合的麦根酸类物质，该种物质具有很强的螯合铁离子的能力，能螯合6个三价铁离子并形成稳定的八面体结构（Fe3＋－MAs）［16］；然后，位于植物根系细胞原生质膜上的Fe3＋－MAs运载系统能专一性地将Fe3＋－MAs转运至植物根系细胞质中［17］；在细胞内，三价铁被还原成二价铁，供细胞利用。与铁吸收及转运有关的基因家族主要包括锌铁转运体蛋白家族（ZIP）、自然抗性相关巨噬蛋白家族（NRAMP）和黄色条纹蛋白家族（YSL）［2］。

本研究利用1.5 mmol／L EDTA－Fe从前期获得的耐盐突变体中筛选到了两个富铁的耐盐小麦新材料LY 1－29和LY 2－7，两者的籽粒铁含量分别比野生型对照高126%和115%；经外源铁诱导，三价铁转运蛋白基因TaFIBP、铁离子跨膜转运蛋白基因TaIITT、Fe3＋－MAS螯合蛋白基因TaYSL1和TaZIP29均在两材料体内不同程度高水平表达，且表达水平高于野生型。说明这些基因的高水平表达可能是导致籽粒铁元素增高的关键因素。AtRTH是AtRTE1的同源基因，我们的前期研究发现拟南芥rth－1突变体对铁离子处理不敏感，暗示该基因可能与铁吸收运输有关。本研究结果显示，TaRTH在耐盐、富铁突变体材料中的表达受铁离子诱导，且表达水平显著高于野生型，这为深入了解RTH蛋白在铁代谢中的功能提供了新材料。

中国营养学会《中国居民膳食营养参考摄入量》中推荐成年男性每日最佳铁摄入量为15 mg，成年女性每日为20 mg［18］。但调查研究发现，目前人们的膳食水平无法达到此标准，铁缺乏成为最大的“隐性饥饿”［6］。我国不同地区不同品种小麦籽粒中的铁含量不同，大多数小麦栽培品种的铁元素含量为32.5～65.6 mg／kg［19－22］。本研究获得的两个小麦耐盐突变体的籽粒铁含量分别为80.00 mg／kg和76.39 mg／kg，远高于市场上的小麦栽培品种，是优质的富铁小麦新材料，为选育优质富铁小麦品种提供了材料。