刘立立，杨进威，姜如云，姜玉梅，李永春，李磊

（河南农业大学农学院／河南农业大学国家小麦工程技术研究中心，河南 郑州 450046）

MicroRNAs（miRNAs）是由21～24个核苷酸（nts）组成的具有重要调节功能的非编码小RNA分子［1，2］。随着近年来高通量测序技术的发展改进，越来越多的miRNAs被识别鉴定出来。研究表明，miRNAs不仅可以调节植物的生长发育和生理过程，在逆境胁迫过程中也发挥调节作用［3，4］。因此，探究miRNAs在植物生长发育过程中的作用机制和逆境响应机制对研究开发植物潜力有着重要意义。

大量研究发现，miR396在不同物种生长发育与逆境胁迫响应过程中发挥重要的作用。水稻中osa－miR396通过调节靶基因GRF对水稻产量以及籽粒大小产生影响［5］。大豆中gma－miR396与GRF之间调控的稳态关系对其根的生长发育发挥着重要作用［6］。在拟南芥中ath－miR396通过与其他miRNAs相互作用共同参与温度、干旱等非生物胁迫过程［7］。在匍匐剪股颖中过表达osa－miR396c，结果引起剪股颖株型发生改变进而提高植株对非生物胁迫的抗性［8］。同时发现在棉花［9］、拟南芥［7］等植物中，miR168、miR171、miR396等miRNAs通过转录后调控来响应温度、干旱胁迫过程，这为miRNAs在极端温度下的作用提供了新的认识。然而目前在小麦中taemiR396介导的非生物应激反应机制尚不明确。本研究着重分析tae－miR396b的染色体位置、序列特征、时空表达及其对逆境胁迫的响应模式，为明确tae－miR396b在小麦生长发育及非生物胁迫响应过程中的生物学功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料与设计

小麦不同组织材料及处理：选取在大田条件下正常生长的中国春（CS）、京841（J841）、豫麦18（YM18）、郑麦004（ZM004）和矮抗58（AK58）成熟的种子和扬花期的穗下节、旗叶、节间、节，于－80℃中保存备用；选取籽粒饱满的上述品种的干种子，利用1.5%的H2O2表面消毒10 min，用灭菌水清洗后，摆放于玻璃培养皿中在光照培养箱（光照强度为240 mmol·m－2·s－1，25℃条件下光照16 h，18℃下黑暗8 h）内培养，待小麦长到二叶一心时取根系和叶片，液氮速冻后于－80℃中保存备用。

高低温胁迫材料及处理：选取豫麦18和京841饱满种子，表面消毒后摆放入玻璃培养皿中，在光照培养箱内培养，待小麦长到二叶一心时，将麦苗分别转至4℃和42℃的恒温光照培养箱中进行模拟高低温胁迫处理；分别在处理0、0.5、1、2、6、12、24 h和48 h时取根系、叶片和茎尖组织，于－80℃保存备用。

1.2 生物信息学分析

利用miRBase数据库（http：／／www.mirbase.org／）对不同物种miR396的信息进行检索；利用Ensembl Plants（http：／／plants.ensembl.org／Triticum_aestivum／Info／Index）数据库，对miR396的染色体进行定位分析；利用RNA Folding Form（http：／／unafold.rna.albany.edu／？q＝mfold／rnafolding－form），对pre－miR396b序列的茎环结构进行预测分析；利用Plant CARE（http：／／bioinformatics.psb.ugent.be／webtools／plantcare／html／），对miRNA上游区域中的启动子元件进行预测分析；利用Primer premier 5.0软件设计引物。

1.3 RNA的提取和TaMIR396b片段克隆

组织材料的RNA提取按照TransZol试剂盒（全式金，北京）说明书操作进行；籽粒材料的RNA提取按照TransZol Plant试剂盒（全式金，北京）说明书操作进行。

RNA质量检测：将提取的总RNA利用琼脂糖凝胶电泳技术检测其质量，利用紫外分光光度计测量其浓度，将检测到的完整的RNA用于下一步反转录。

RNA的反转录：用于克隆TaMIR396b基因的cDNA，按照FastKing RT Kit With gDNase（天根，北京）的说明书进行反转录；用于tae－miR396b表达特性分析的cDNA的反转录，按照TransScript®miRNA First－Strand cDNA Synthesis Super-Mix试剂盒（全式金，北京）的说明书进行反转录。合成得到的cDNA于－20℃冰箱保存备用。

TaMIR396b片段克隆：以上述反转录得到的cDNA作为模板，通过引物L01和L02（表1）克隆TaMIR396b片段，对克隆得到产物进行跑胶检测，将目的片段切胶回收、连接转化到大肠杆菌感受态细胞，挑取单克隆，通过A、B基因组特异引物L03、L04（表1）对重组克隆进行鉴定，挑选与目的条带大小一致的单克隆，送公司测序分析。

表1 RT－PCR及qRT－PCR引物

1.4 表达特性分析

以上述cDNA作为模板，U6作为内参基因（表1），qRT－PCR体系及程序按照TransStart®Top Green qPCR SuperMix（全式金，北京）说明书进行。qRT－PCR反应程序（两步法进行）：预变性94℃2 min；变性94℃5 s；退火／延伸60℃10 s；熔解曲线：65～95℃（0.5℃／s，5 s）。反应设置40个循环进行。qRT－PCR 得到数据，通过2－△△Ct法计算，用Microsoft Excel作图分析。

2 结果与分析

2.1 tae－miR396b序列特征分析

通过miRBase数据库获得不同物种中miR396b的成熟序列，序列对比分析结果显示，不同物种间成熟的miR396b序列高度一致（图1A），因此该miRNA高度保守，推测其功能可能也具有保守性。利用 EnsemblPlants对 taemiR396b的成熟序列进行基因组对比分析，结果将tae-miR396b定位于第6号染色体的长臂上；通过 NCBI（https：／／blast.ncbi.nlm.nih.gov／Blast.cgi）进行TaMIR396b的3个部分同源基因序列对比分析，结果表明，3个同源基因部分一致性较高，与6AL序列相比，6BL和6DL的序列一致性分别为90%和95%，且3个同源基因间存在SNP和InDel差异（图1B）。

通过PlantCARE 网站对TaMIR396b上游2 000 bp的区域进行启动子预测分析，结果表明，上游启动子区域包含有TATA－box转录起始位点、MYB盐胁迫启动子元件、MYC抗寒性启动子功能元件、水杨酸顺式响应元件、ABRE脱落酸响应元件、ARE抗氧化调节元件、G－box和Sp1光响应顺式元件、CCGTCC－motif分生组织表达元件、LTR低温响应元件、GT1－motif光响应元件、RY－element种子特异相关元件等多个调控元件（图1C）。

图1 TaMIR396b序列特征分析

2.2 TaMIR396b基因的克隆

通过设计引物L01和L02从中国春、豫麦18和京841的cDNA中分别扩增获得TaMIR396b基因片段，长度在192 bp左右（图2A）。将克隆得到的TaMIR396b片段进行回收测序，测序结果利用APE软件进行序列分析，结果（图2B）显示，3个品种间存在SNP和InDel差异，在第47、52、86、88、94、116个核苷酸位置处豫麦18和京841中分别存在1个SNP差异，在77、82个核苷酸位置处存在 InDel差异。将测序结果正确的TaMIR396b序列利用RNA Folding Form网站进行二级结构预测分析，结果（图2C）表明A、B和D同源基因均能形成特定的茎环结构。

图2 TaMIR396b基因的克隆及序列特征分析

2.3 小麦tae－miR396b的组织表达特性

通过对tae－miR396b在5个品种不同组织中的表达模式分析（图3）表明，tae－miR396b在不同组织中均有表达，但不同组织间的相对表达量存在较大差异，比如，节间中相对表达量均较高，旗叶中相对表达量均较低。tae－miR396b在5个品种间相对表达量也存在差异，在种子和穗下节中差异较大。在京841和矮抗58的节间、穗下节和节中，tae－miR396b的相对表达量显著高于豫麦18、郑麦004和中国春；在京841和矮抗58的成熟种子中，tae－miR396b的相对表达量显著低于豫麦18、郑麦004和中国春。taemiR396b的相对表达量在不同品种间表达存在较大差异，可能与品种发育特性相关。总体来看，tae－miR396b在5个品种的不同组织中相对表达量均存在差异，推测tae－miR396b在小麦生长发育过程中发挥调控作用。

图3 tae－miR396b的组织表达特性分析

2.4 小麦tae－miR396b对高低温胁迫的响应

在4℃低温胁迫下（图4A、4B和4C），taemiR396b在豫麦18和京841中均表现出受低温胁迫诱导先上调表达而后下调表达的变化趋势，但两个品种不同器官间tae－miR396b的表达水平和动态趋势存在较大差异。豫麦18和京841叶片中（图4A），tae－miR396b在胁迫后表达迅速上调，1 h时达到峰值，后下调表达，两品种均出现上调下降波动。与京841相比，taemiR396b在豫麦18中的表达变化幅度较大，整体来看，豫麦18叶片中该miRNA对低温胁迫的响应要比京841更快，这可能与豫麦18具有弱春性有关。豫麦18茎尖中（图4B），tae－miR396b受胁迫1 h后出现快速表达上调，2 h时达到峰值，后表达下调；而京841茎尖中，tae－miRNA则整体表现先缓慢上调表达，12 h达到最高，然后表达下调。根系中（图4C），京 841的 taemiR396b在胁迫2 h后快速上调表达，6 h时达到峰值，而后迅速下调表达；而在豫麦18中先迅速上调表达，并且分别在0.5 h和6 h出现表达峰值，而后表达下调。该miRNA在叶片、茎尖和根系中表现出相似的表达模式，推测tae－miR396b在小麦低温胁迫过程中发挥着一定的作用。

42℃高温胁迫下，豫麦18和京841叶片中tae－miR396b的表达水平出现先短暂下调表达然后上调表达而后下调表达的变化趋势，24 h后，豫麦18的tae－miR396b表达趋于平稳，而京841又快速上调表达（图4D）。两品种茎尖中（图4E），tae－miR396b在豫麦18中整体表现为受高温胁迫先表达上调，0.5 h达到峰值而后下调表达，变化趋势趋于平稳；京841中，tae－miR396b表达变化趋势较大，出现先上调后下调表达然后上调后下调再上调表达的变化趋势，与豫麦18相比，京841中该miRNA对高温胁迫处理的响应更加强烈。京841和豫麦18的根系中（图4F），taemiR396b呈现不同的表达变化趋势：京841中，tae－miR396b呈现下调－上调－下调－上调－下调表达的变化趋势，在1 h和6 h出现表达峰值；豫麦18中，tae－miR396b的表达整体呈现出下调的变化趋势，与豫麦18相比京841具有更高的表达水平。高温胁迫下，tae－miR396b在两个品种小麦根系中表达模式差异较大，推测这可能与两个品种的春冬性有一定的关系；在叶片和茎尖中整体表达趋势相似，证明该miRNA在小麦高温胁迫过程中发挥着一定的作用。

图4 tae－miR396b在高低温胁迫过程中的表达模式

3 讨论与结论

随着第一个miRNA 在秀丽线虫中被发现［10］，越来越多的miRNAs被发现。miRNAs通过剪切［11－13］、翻译抑制［14，15］或DNA甲基化［16，17］三种方式调控靶基因进而对植物的生长发育及在逆境胁迫响应中发挥调控作用。在匍匐剪股草中过表达miR396改变叶片大小进而提高植株对逆境的适应性［8］；水稻中miR396通过调节水稻的株型以及籽粒大小进而对产量产生影响［18］等。基于实验室前期基础研究，发现miR396b在小麦的生长发育过程中发挥着重要作用［19］。本研究结果表明，tae－miR396b基因在小麦不同组织部位均有表达，且在节间相对表达量较高，说明该基因广泛参与了小麦各组织的发育过程。通过对tae－miR396b基因上游调控区域启动子预测分析发现，该区域存在着一些与生长发育相关的调控元件，如CCGTCC－motif分生组织表达元件、TCA水杨酸响应顺式元件和RY－element种子特异相关元件等多个调控元件，这些启动子元件可能是影响tae－miR396b在不同组织中存在差异表达的重要因素。

miRNAs在植物中的作用涉及到生长、发育、代谢调控等各个方面，包括种子萌发［20］、活性氧清除［21］、激素信号转导［22］、植物器官形态发育［23］以及逆境胁迫应答［24］等。研究表明，miR1432、miR444、miR319 响应植物的低钾胁迫［25］；miR1139在调节小麦对Pi缺乏的耐受性中起关键作用［26］；miR167则参与小麦的发育和抗渗透胁迫［27］。此外，近来的研究表明，miR396参与包括温度［9，8］、盐［7，28］和干旱［29］等多种非生物胁迫响应的调控。本研究结果表明，tae－miR396b对高低温逆境胁迫均有响应，在根系、茎尖和叶片中表现出不同的响应模式，这可能与温控胁迫的信号通路有关。通过tae－miR396b基因上游调控区域启动子预测分析发现，该区域存在着与胁迫响应相关的调控元件，如MYB盐胁迫启动子元件、MYC抗寒性启动子功能元件、ARE抗氧化调节元件、脱落酸响应元件（ABRE和A－box）、光响应元件（G－box、Sp1、AE－box和GT1－motif）、温度响应元件（MYC和LTR）等，这些调控元件可能是影响tae－miR396b参与逆境胁迫响应的调控因子。

综上，miRNAs在小麦生长发育过程和非生物胁迫响应过程中存在调节作用。本研究克隆了不同小麦品种中的tae－miR396b基因，并对其在不同品种中的组织表达特性以及对高低温胁迫的应激响应进行了分析。下一步将继续对taemiR396b进行生物学功能分析，为完善小麦非生物胁迫响应生理机制和分子机制提供必要的理论依据，确定tae－miR396b调控的下游靶基因，并进行功能分析和试验验证，阐明其内在的调控网络。