刘慧 张虹丽 田姗

急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)是常见的儿童恶性疾病，发病率呈增长趋势[1]。近年来，随着医疗水平的进步，尽管ALL患者5年生存率明显提高，但仍有部分患儿治疗疗效不佳[2]。目前，ALL发生发展的机制仍未阐明，深入研究影响ALL发生发展的分子机制对其治疗靶点的选择具有重要意义。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类长度约为18～25个核苷酸的小分子单链非编码RNA，可与靶信使RNA(mRNA)的3’非翻译区(3’untranslated region，3’UTR)靶向结合，抑制靶mRNA的翻译或降解靶mRNA，从而在转录后水平调控靶基因的表达，在血液系统疾病中发挥重要作用[3]。研究显示，miR-103b在ALL患者中表达升高，可作为临床诊断该疾病的潜在分子标志物[4]。但是，miR-103b对ALL细胞增殖和凋亡的影响还未知。生物信息学软件预测显示，生长抑制蛋白家族成员5(inhibitor of growth family member 5，ING5)可能是miR-103b的靶基因。ING5基因定位于染色体2q37.3，具有抑制细胞生长并诱导细胞凋亡的作用，是一种抑癌基因。研究显示，ING5过表达可抑制胃癌[5]、甲状腺癌[6]、食管鳞状细胞癌[7]等肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭等恶性生物学行为，发挥抗肿瘤作用。目前，ING5对ALL细胞增殖和凋亡的影响也还未知。本研究以急性T淋巴细胞白血病细胞Molt4为研究对象，主要探讨了miR-103b对Molt4细胞增殖和凋亡的影响及其是否通过调控ING5表达影响Molt4细胞的增殖和凋亡，以期为进一步阐明ALL发生发展的分子机制及治疗靶点的寻找提供新思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2016年2月至2018年10月于西安交通大学附属三二○一医院确诊并治疗的37例ALL患儿为ALL组，其中男21例，女16例；年龄3～12岁，平均年龄(7.23±2.15)岁。另选取同时期16例血小板减少症患儿为对照组，其中男9例，女7例；年龄5～10岁，平均年龄(6.89±2.57)岁。取2组患儿骨髓标本5 ml，加入等体积PBS稀释后，使用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，预冷的磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)清洗2次，-80℃保存备用。本研究经本院伦理委员会批准同意，患者家属自愿签署知情同意书。

1.2 细胞与主要试剂 急性淋巴细胞白血病细胞Molt4(中国科学院上海细胞库)，胎牛血清(fet al bovine serum，FBS)和RPMI 1640培养基(美国Gibco公司)，四甲基噻唑蓝(methylthiazoletrazolium，MTT)和胰蛋白酶(美国Sigma公司)，逆转录试剂盒和PCR试剂盒(深圳晶美生物工程有限公司)，Trizol试剂和LipofectamineTM 2000试剂盒(美国Invitrogen公司)，miR-103b抑制剂、模拟物(mimics)及阴性对照、ING5小干扰RNA(si-ING5)及乱序无意义阴性序列(si-NC)(上海吉玛制药技术有限公司)，PCR引物(上海生工生物工程有限公司)，二喹啉甲酸(bicinchoninicacid，BCA)蛋白检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)，膜联蛋白V(Annexin V)-异硫氰酸荧光素(FITC)/碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)细胞凋亡试剂盒(上海翊圣生物科技有限公司)，双荧光素酶活性检测试剂盒(美国Promega公司)，细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、P21、B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、B淋巴细胞瘤-2相关蛋白(Bcl-2-associated X protein，Bax)多克隆抗体(美国Santa Cruz公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 Molt4细胞培养:复苏Molt4细胞后，加入含10% FBS的RPMI 1640培养基，置于培养箱(37℃、5%CO2、97%湿度)中培养。每2～3天更换1次新鲜培养基。当细胞融合至80%～90%时，吸弃培养基，加入预冷的PBS清洗细胞。吸弃PBS后，加入0.25%胰蛋白酶溶液消化，显微镜下观察细胞形态为圆形时，加入含 FBS的RPMI 1640培养基终止消化，进行传代培养。

1.3.2 Molt4细胞转染和分组:将对数生长期的Molt4细胞接种于6孔板中，每孔1×105个细胞。当细胞融合至60%时，参照LipofectamineTM 2000试剂盒操作说明书，分别将miR-103b抑制剂(anti-miR-103b组)及阴性对照(anti-miR-NC组)、miR-103b mimcs(miR-103b 组)及阴性对照(miR-NC组)、miR-103b抑制剂与si-ING5(anti-miR-103b+si-ING5组)、miR-103b抑制剂与si-NC(anti-miR-103b+si-NC组)转染至Molt4细胞。转染12 h后，更换新鲜培养基。继续培养至48 h后，收集细胞，实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR，RT-qPCR)检测细胞中miR-103b水平评价转染效果。

1.3.3 RT-qPCR检测miR-103b表达水平:Trizol试剂盒提取骨髓单个核细胞或Molt4细胞中总RNA，微量核酸仪检测RNA的纯度和浓度。然后参照逆转录试剂盒将其逆转录为cDNA。并以cDNA为模板，进行扩增。扩增程序为95℃预变性5 min，95℃变性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共进行35个循环。引物序列miR-103b上游5’-GAGCAGCATTGTACAG-3’，下游5’-GTGCAGGGTCCGAGG T-3’；U6上游5’-CTCGCTTCGGCAGGGACA-3’，下游5’-AACGGTTCACGAATTTGCGT-3’。以U6为内参，采用2-ΔΔCt法计算miR-103b相对表达水平。

1.3.4 MTT检测细胞增殖:转染后的2组细胞接种于96孔板中，每孔5×103个细胞。培养箱中培养48 h后，每孔加入20 μl浓度为5 g/L的MTT溶液，继续孵育4 h。吸弃培养基，加入150 μl二甲基亚砜，振荡混匀，于酶标仪490 nm处测定吸光度值(absorbance，A)。细胞存活率(%)=A实验组/A对照组×100%。

1.3.5 流式细胞仪检测细胞凋亡:2组转染后的Molt4细胞接种于24孔板中，每孔1×104个细胞。培养箱中培养48 h后，吸弃培养基，加入适量0.25%胰蛋白酶消化，收集细胞。取1.0×106个细胞，PBS清洗2次。参照Annexin V-FITC/PI试剂盒操作说明书，加入400 μl结合缓冲液，轻轻吹打，混悬细胞。依次加入10 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，室温避光孵育10 min。再加入100 μl结合缓冲液，涡旋混匀后，流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.3.6 蛋白印迹(Western Blot)法检测CyclinD1、P21、Bcl-2和Bax蛋白表达:转染后的各组细胞培养48 h后，收集细胞，PBS清洗2次。吸弃PBS，细胞中加入RIPA蛋白裂解液，置于冰上充分裂解，提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。取适量蛋白溶液，100℃煮沸5 min。蛋白变性后，进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，每孔蛋白上样量为30 μg。电泳结束后，湿转至聚偏乙烯二氟膜。转膜后，置于5%脱脂牛奶中封闭2 h。分别加入CyclinD1(稀释度1∶600)、P21(稀释度1∶400)、Bcl-2(稀释度1∶400)和Bax(稀释度1∶400)抗体，4℃孵育过夜。加入辣根过氧化酶标记的二抗(稀释度1∶200)，37℃孵育1 h。滴加ELC显影液，避光显影后凝胶成像系统曝光拍照。

1.3.7 双荧光素酶报告基因实验验证miR-103b和ING5靶向关系:生物信息学软件预测显示，ING5的3’UTR存在与miR-103b核苷酸序列结合的位点。PCR扩增含miR-103b结合位点的ING5的3’UTR序列，构建ING5野生型质粒(WT-ING5)和突变型质粒(MUT-ING5)。分别将WT-ING5、MUT-ING5与miR-103b mimic、阴性对照共转染至Molt4细胞。转染12 h后，更换新鲜培养基。继续培养至48 h，收集细胞。参照双荧光素酶活性检测试剂盒操作说明，检测荧光素酶活性，以荧光虫活性/海肾荧光强度比值表示各组的荧光素酶活性。

2 结果

2.1 miR-103b在急性淋巴细胞白血病患者骨髓中的表达 与对照组比较，白血病患者骨髓中miR-103b表达水平升高(P<0.05)。见表1。

表1 miR-103b在急性淋巴细胞白血病患者骨髓中的表达

2.2 抑制miR-103b对Molt4细胞增殖和凋亡的影响 与anti-miR-NC组比较，anti-miR-103b组Molt4细胞中miR-103b水平降低(P<0.05)，说明miR-103b抑制剂转染成功，Molt4细胞中miR-103b表达受到抑制。与nti-miR-NC组比较，anti-miR-103b组细胞存活率、Cyclin D1和Bcl-2蛋白水平降低(P<0.05)，细胞凋亡率、P21和Bax蛋白水平升高(P<0.05)。见图1，表2、3。

图1 抑制miR-103b对Molt4细胞增殖和凋亡的影响;A 抑制miR-103b对Molt4细胞凋亡的影响；B 抑制miR-103b对Molt4细胞增殖、凋亡蛋白表达的影响

表2 抑制miR-103b对Molt4细胞增殖的影响

表3 抑制miR-103b对Molt4细胞凋亡的影响

2.3 miR-103b靶向调控ING5表达 生物信息学软件预测显示，ING5的3’UTR含有与miR-103b互补的核苷酸序列。双荧光素酶活性检测结果显示，与miR-NC组比较，miR-103b组共转染WT-ING5的荧光素酶活性降低(P>0.05)，而共转染MUT-ING5的荧光素酶活性物明显变化(P>0.05)，说明miR-103b可与ING5的3’UTR靶向结合。miR-103b组ING5蛋白水平低于miR-NC组(P>0.05)，anti-miR-103b组ING5蛋白水平高于anti-miR-NC组(P>0.05)，进一步说明miR-103b靶向负调控ING5表达。见图2，表4、5。

表4 双荧光素酶实验结果

图2 miR-103b靶向调控ING5表达;A ING5的3’UTR含有miR-103b的互补序列；B miR-103b调控ING5的表达

2.4 抑制ING5能逆转抑制miR-103b对Molt4细胞增殖的抑制作用 与anti-miR-103b+si-NC组比较，anti-miR-103b+si-ING5组Molt4细胞中ING5蛋白水平降低(P<0.05)，说明ING5小干扰RNA转染成功，Molt4细胞中ING5表达受到抑制。与anti-miR-103b+si-NC组比较，anti-miR-103b+si-ING5组细胞存活率、Cyclin D1蛋白水平升高(P<0.05)，P21蛋白水平降低(P<0.05)。见图3，表6。

表5 miR-103b调控ING5的表达

图3 抑制ING5能逆转抑制miR-103b对Molt4细胞增殖蛋白表达的影响

表6 抑制ING5能逆转抑制miR-103b对Molt4细胞增殖的影响

2.5 抑制ING5能逆转抑制miR-103b对Molt4细胞凋亡的促进作用 与anti-miR-103b+si-NC组比较，anti-miR-103b+si-ING5组细胞凋亡率和Bax蛋白水平降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平升高(P<0.05)。见表7，图4。

表7 抑制ING5能逆转抑制miR-103b对Molt4细胞凋亡的影响

图4 抑制ING5能逆转抑制miR-103b对Molt4细胞凋亡的影阿响;A 抑制ING5能逆转抑制miR-103b对Molt4细胞凋亡的影响；B 抑制ING5能逆转抑制miR-103b对Molt4细胞凋亡蛋白表达的影响

3 讨论

ALL是一种血液系统疾病，其显著特征是细胞过度增殖和凋亡抑制[8]。因此，抑制ALL细胞的异常增殖并诱导细胞凋亡可延缓该疾病的发展进程。miRNA参与调控细胞的增殖、分化、凋亡等生命过程，是血液系统疾病、肿瘤等疾病的潜在治疗靶点[9,10]。探讨ALL患者体内异常表达的miRNA及miRNA对ALL细胞增殖、凋亡的影响和作用机制，对于ALL疾病发生发展机制的阐明和治疗靶点的寻找提供新思路。

miR-103b是近几年新发现的一种miRNA。黄耿等[11]研究显示，miR-103b可通过激活肾癌细胞中P21蛋白的表达，阻滞肾癌细胞周期的进展，抑制肾癌细胞的生长。目前，miR-103b对ALL细胞生物学行为的影响还未知。本研究显示，miR-103b在ALL患者骨髓中表达升高，提示miR-103b可能参与ALL疾病的发生发展。通过转染miR-103b抑制剂至Molt4细胞后，Molt4细胞存活率降低，凋亡率升高，说明抑制miR-103b表达可抑制Molt4细胞增殖，并诱导细胞凋亡。Cyclin D1是细胞周期关键调控蛋白之一，可促进G1期向S期转变，加速细胞增殖[12]。P21是肿瘤生长抑制因子，其表达升高可抑制肿瘤发展。本研究显示，抑制miR-103b表达后，Molt4细胞中Cyclin D1蛋白表达降低，而P21蛋白表达升高，提示抑制miR-103b表达通过调控Cyclin D1和P21蛋白表达抑制Molt4细胞增殖。抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax在细胞凋亡过程中发挥重要作用，Bcl-2表达升高抑制细胞凋亡，而Bax表达升高则促进细胞凋亡[13]。本研究显示，抑制miR-103b表达后，Molt4细胞中Bcl-2蛋白表达降低，而Bax蛋白表达升高，提示抑制miR-103b表达通过调控Bcl-2和Bax蛋白表达诱导Molt4细胞凋亡。

为了进一步探讨miR-103b影响ALL细胞增殖和凋亡的作用机制，本研究通过生物信息学软件预测显示，ING5可能是miR-103b的靶基因。双荧光素酶活性检测结果显示，miR-103b可与ING5的3’UTR靶向结合。此外，上调Molt4细胞中miR-103b表达后，ING5蛋白水平降低，而下调miR-103b表达后，ING5蛋白水平升高，证实了miR-103b在Molt4细胞中靶向负调控ING5表达。ING5是生长抑制蛋白家族成员成员之一，参与调控细胞生长、凋亡等生物学行为，已被证实在肿瘤中发挥抗肿瘤作用。Liu等[14]研究显示，ING5过表达可通过抑制WNT/β-catenin途径抑制肺癌的侵袭和上皮间质转化。Xie等[15]研究显示，miR-181b通过靶向下调ING5表达促进肝癌细胞的增殖，影响肝癌发展进程，miR-181b/ING5轴为肝癌的靶向治疗提供了新途径。宋洋等[16]研究显示，ING5过表达可抑制乳腺癌Bcap-37细胞的增殖和迁移，并诱导细胞周期G2期阻滞和细胞凋亡，ING5可作为乳腺癌基因治疗的分子靶标。这些研究均说明了ING5基因在肿瘤中发挥抗肿瘤作用，通过上调ING5表达可抑制肿瘤发展进程，为肿瘤治疗靶点的选择提供了新思路。目前，ING5在ALL疾病中的作用还未知。本研究显示，抑制ING5表达逆转了抑制miR-103b表达对Molt4细胞增殖和凋亡的影响，提示miR-103b通过靶向上调ING5表达抑制Molt4细胞增殖，并诱导细胞凋亡，是治疗ALL疾病的潜在分子靶点。

综上所述，抑制miR-103b表达可抑制ALL细胞增殖，应诱导细胞凋亡，其可能通过靶向上调ING5表达发挥作用，miR-103b/ING5轴为ALL疾病的靶向治疗提供了新途径。