姜永宁

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一种常见的神经退行性疾病，主要发生于>60岁人群。PD的主要病理改变为中脑黑质致密部多巴胺能神经元丢失和残存神经元胞内α-突触核蛋白聚集沉积。研究认为，PD黑质多巴胺能神经元变性中存在细胞凋亡现象，凋亡是PD多巴胺能神经元死亡的主要机制[1]，降低神经细胞凋亡对于PD疾病的治疗具有积极意义。1-甲基-4-苯基吡啶(MPP+)是一种常用的多巴胺神经元毒素，其诱导多巴胺能神经元凋亡已广泛用于PD的体外细胞模型研究[2]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类长度为18～25个核苷酸的小分子非编码RNA，可与靶基因mRNA的3’非翻译区(3’untranslated region，3’UTR)靶向结合，抑制靶mRNA翻译或降解靶mRNA，从而在转录后水平调控基因的表达，参与PD的发生发展过程[3,4]。研究显示，经左旋多巴治疗后的PD患者血清中miR-30a-5p的表达水平显著上调，miR-30a-5p可能是PD的潜在生物标记物[5]。但miR-30a-5p与PD的具体关系及调控机制还未被阐明。Starbase生物信息学软件预测显示，泛素特异性蛋白酶22(ubiquitin specific protease 22，USP22)的3’UTR与miR-30a-5p的核苷酸序列存在连续的结合位点，提示USP22可能是miR-30a-5p的靶基因。USP22属于DUBs家族，参与组蛋白去泛素化、乙酰化进而参与hSAGA复合物所调节的基因转录与表达等。目前认为USP22是肿瘤标志物，与肿瘤复发、转移及预后密切相关[6]，其在PD中的作用笔者还未见相关报道。本研究旨在探讨miR-30a-5p对MPP+诱导的人神经母细胞瘤(SK-N-SH)细胞增殖和凋亡的影响及其能否通过调控USP22影响MPP+诱导的SK-N-SH细胞增殖和凋亡，以期为PD的靶向分子治疗提供新途径。报告如下。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂 人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞购自中国科学院上海细胞库，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)购自美国Hycolne公司，DMEM培养基购自北京索莱宝科技有限公司，细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8，CCK-8)、二喹啉甲酸(bicinchoninicacid，BCA)蛋白检测试剂盒、膜联蛋白V(Annexin V)-异硫氰酸荧光素(FITC)/碘化丙啶(propidium iodide，PI)细胞凋亡试剂盒和双荧光素酶活性检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，Trizol试剂和LipofectamineTM 2000试剂盒购自美国Invitrogen公司，逆转录试剂盒和PCR试剂盒购自深圳晶美生物工程有限公司，PCR引物购自上海生工生物工程有限公司，细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、活化的半胱天冬酶-3(Cleaved-caspase-3)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗体购自美国Santa Cruz公司，miR-30a-5p 模拟物(mimcs)及模拟阴性对照序列(miR-NC)、miR-30a-5p抑制剂(anti-miR-30a-5p)及抑制剂阴性对照序列(anti-miR-NC)、USP22的小干扰RNA(si-USP22)及乱序无意义阴性序列(si-NC)、USP22过表达载体(pcDNA-USP22)及空载体(pcDNA-NC)购自上海吉凯基因化学技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与转染:SK-N-SH细胞用含10% FBS的RPMI 1640培养基培养。培养箱条件：温度37℃、CO2体积分数5%、湿度97%。每2～3天更换一次新鲜的培养基。待细胞生长密度至80%时，0.25%胰蛋白酶消化，以1∶3比例进行传代培养。取对数生长期的SK-N-SH细胞，以每孔1×105个细胞接种于6孔板中。待细胞生长密度至60%时，更换不含FBS的DMEN培养基。参照LipofectamineTM 2000试剂盒说明书，分别将miR-30a-5p mimcs(miR-30a-5p 组)、miR-NC(miR-NC组)、anti-miR-30a-5p(anti-miR-30a-5p组)、anti-miR-NC(anti-miR-NC组)、si-USP22(si-USP22组)、si-NC(si-NC组)、miR-30a-5p mimcs与pcDNA-USP22(miR-30a-5p+pcDNA-USP22组)及miR-30a-5p mimcs与pcDNA-NC(miR-30a-5p+pcDNA-NC组)转染至SK-N-SH细胞。转染6 h后，更换含10%FBS的DMEM培养基。继续培养至48 h后，收集细胞用于后续实验。

1.2.2 细胞分组处理:未转染的SK-N-SH细胞分为对照组(NC组)和MPP+组，每组3个复孔，NC组细胞正常培养，MPP+组细胞采用含1 mmol/L[7]MPP+的培养基作用24 h。miR-30a-5p组、miR-NC组、si-USP22组、si-NC组、miR-30a-5p+pcDNA-USP22和miR-30a-5p+pcDNA-NC组细胞均用含1 mmol/L MPP+的培养基作用24 h，每组3个复孔，并分别记为MPP++miR-30a-5p组、MPP++miR-NC组、MPP++si-USP22组、MPP++si-NC组、MPP++miR-30a-5p +pcDNA-USP22和MPP++ miR-30a-5p+pcDNA-NC组。

1.2.3 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测细胞中miR-30a-5p和USP22 mRNA表达:Trizol试剂提取各组细胞中总RNA，微量核酸仪检测RNA的纯度和浓度，其在260 nm和280 nm处吸光度值(absorbance，A)的比值A260 nm/A280 nm处于1.8～2.0范围内说明其纯度较好，可用于扩增。参照逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA后，进行PCR扩增。扩增条件：95℃预变性10 min，95℃变性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共进行35个循环。引物序列：miR-30a-5p正向引物5’-CGTAGAGCTGATCGACGATG-3’，反向引物5’-GTG TCACCGTAACGTGACG-3’；USP22正向引物5’-TTCACCAGACCAGAGCACTT-3’，反向引物5’-CATACGTGGTGATCTTCCGC-3’；U6正向引物5’-TGCGGGTGCTCGCTTCGCAGC-3’，反向引物5’-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’；β-actin正向引物5’-GCCGGGACCTGACT GACTAC-3’，反向引物5’-CGGAGTACTTGCGCTCAGGA-3’。miR-30a-5p以U6为内参，USP22以β-actin为内参，2-ΔΔCt法计算miR-30a-5p和USP22 mRNA的相对表达水平。

1.2.4 Western Blot法检测细胞中USP22、CyclinD1和Cleaved-caspase-3蛋白表达:细胞以每孔2.5×104个接种于24孔板中，按照1.2.2分组处理后，吸弃培养基，加入RIPA细胞裂解液充分裂解细胞，提取细胞中总蛋白。BCA蛋白试剂盒测定蛋白浓度后进行定量，以每泳道30 μg蛋白行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。电泳结束后，湿转至聚偏乙烯二氟(PVDF)膜，并置于5%脱脂奶粉中封闭2 h。分别置于USP22、CyclinD1、Cleaved-caspase-3和β-actin抗体孵育液中，4℃冰箱孵育过夜。TBST洗膜后，置于辣根过氧化酶标记的二抗孵育液中，37℃孵育1 h。TBST洗膜后，滴加ELC化学发光试剂，避光显影后凝胶成像系统曝光拍照，Image J软件分析蛋白条带灰度值。

1.2.5 CCK-8检测细胞存活率:细胞以每孔0.5×104个接种于96孔板中，按照1.2.2分组处理后，每孔加入10 μl CCK-8试剂，继续孵育4 h后酶标仪490 nm处测定A。细胞存活率(%)=A实验组/ANC组×100%。实验重复3次。

1.2.6 流式细胞仪检测细胞凋亡:细胞以每孔2.5×104个接种于24孔板中，按照1.2.2分组处理后，吸弃培养基，胰蛋白酶消化，收集细胞，适量磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)清洗2次。取1.0×106个细胞，加入500 μl结合缓冲液。混悬细胞后，加入10 μl Annexin V-FITC，室温避光孵育10 min。加入5 μl PI，室温避光孵育10 min，流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.2.7 双荧光素酶报告基因实验验证miR-30a-5p与USP22靶向关系:PCR扩增含miR-30a-5p结合位点的USP22的3’UTR序列，将其克隆至GV272载体中，构建USP22野生型双荧光素酶报告质粒(WT-USP22)。利用基因突变技术将结合位点突变后，同样克隆至GV272载体中，构建USP22突变型双荧光素酶报告质粒(MUT-USP22)。分别将WT-USP22、MUT-USP22与miR-30a-5p mimic、miR-NC共转染至SK-N-SH细胞。转染6 h后，更换含10%FBS的DMEM培养基。继续培养至48 h后，收集细胞并裂解，参照双荧光素酶活性检测试剂盒说明书检测荧光素酶活性。

2 结果

2.1 MPP+对SK-N-SH细胞中miR-30a-5p和USP22表达的影响 与NC组比较，MPP+组细胞中miR-30a-5p表达水平显著降低(P<0.05)，USP22 的mRNA和蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。见图1，表1。

图1 Western Blot检测MPP+诱导SK-N-SH细胞后USP22蛋白表达

表1 MPP+对SK-N-SH细胞中miR-30a-5p和USP22表达的影响

2.2 上调miR-30a-5p对MPP+诱导的SK-N-SH细胞增殖和凋亡的影响 与NC组比较，MPP+组细胞存活率和CyclinD1蛋白表达水平显著降低(P<0.05)，细胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。与MPP++miR-NC组比较，MPP++miR-30a-5p组细胞存活率和CyclinD1蛋白表达水平显著升高(P<0.05)，细胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。见图2，表2。

图2 上调miR-30a-5p对MPP+诱导的SK-N-SH细胞细胞凋亡及相关蛋白表达的影响;A 流式细胞仪检测细胞凋亡；B Western Blot检测CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白的表达

表2 上调miR-30a-5p对MPP+诱导的SK-N-SH细胞增殖、凋亡及相关蛋白表达的影响

2.3 下调USP22对MPP+诱导的SK-N-SH细胞增殖和凋亡的影响 与MPP++si-NC组比较，MPP++si-USP22组细胞存活率和CyclinD1蛋白表达水平显著升高(P<0.05)，细胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。见表3，图3。

表3 下调USP22对MPP+诱导的SK-N-SH细胞增殖、凋亡及相关蛋白表达的影响

图3 Western Blot检测USP22、CyclinD1和Cleaved-caspase-3蛋白的表达

2.4 miR-30a-5p靶向USP22表达 Starbase生物信息学软件预测显示，USP22的3’UTR与miR-30a-5p的核苷酸序列存在连续的结合位点。双荧光素酶活性检测结果显示，与共转染WT-USP22的miR-NC组比较，共转染WT-USP22的miR-30a-5p组细胞双荧光素酶活性显著降低(P<0.05)，而与共转染MUT-USP22的miR-NC组比较，共转染MUT-USP22的miR-30a-5p组细胞双荧光素酶活性无显著变化(P>0.05)。与miR-NC组比较，miR-30a-5p组细胞中USP22蛋白表达水平显著降低(P<0.05)；与anti-miR-NC组比较，anti-miR-30a-5p组细胞中USP22蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。见图4，表4、5。

图4 miR-30a-5p靶向USP22表达;A miR-30a-5p和USP22的结合位点；B Western Blot检测USP22蛋白表达

表4 双荧光素酶活性检测结果

表5 miR-30a-5p对USP22蛋白表达的影响

2.5 上调USP22逆转miR-30a-5p对MPP+诱导的SK-N-SH细胞增殖和凋亡的影响 与MPP++miR-30a-5p+pcDNA-NC组比较，MPP++miR-30a-5p+pcDNA-USP22组细胞存活率和CyclinD1蛋白表达水平显著降低(P<0.05)，细胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。见图5，表6。

图5 Western Blot检测USP22、CyclinD1和Cleaved-caspase-3蛋白表达

表6 上调USP22逆转上调miR-30a-5p对MPP+诱导的SK-N-SH细胞增殖、凋亡及相关蛋白表达的影响

3 讨论

PD的发病率仅次于阿尔茨海默病，是第二大神经退行性疾病，其病因和发病机制目前尚不明确[8]。PD的特征性病理改变是中脑黑质致密部多巴胺能神经元的变性和坏死，延缓多巴胺能神经元的变性可阻止PD发展进程。研究显示，多巴胺能神经元的过度凋亡引起帕金森病的中心环节，多种病因最终都是引起细胞凋亡导致帕金森发病[9]。MPP+具有神经毒性，可诱导多巴胺神经元的凋亡，常被用于体外帕金森细胞模型研究。本研究显示，MPP+诱导SK-N-SH细胞后，细胞增殖能力降低，凋亡率升高，与相关报道结果[10]一致，说明MPP+抑制SK-N-SH细胞增殖，并促进细胞凋亡。

miRNA在真核生物中广泛存在，参与调控细胞的增殖、凋亡等生物学行为，在人类多种疾病的发生发展中起重要作用。miR-30a-5p属于miR-30家族成员，目前对其研究主要集中在肿瘤方面。研究显示，miR-30a-5p在非小细胞肺癌、胰腺癌、皮肤鳞状细胞癌等肿瘤中表达降低，上调其表达可降低肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭等，是肿瘤治疗的潜在分子靶点[11-13]。然而，miR-30a-5p在PD发生发展中的作用和调控机制还未知。CyclinD1是细胞周期相关蛋白，其表达增殖可加速细胞周期进程，促进细胞增殖[14]。本研究显示，上调miR-30a-5p后，MPP+诱导SK-N-SH细胞存活率和CyclinD1蛋白表达升高，上调miR-30a-5p可能通过上调CyclinD1蛋白表达促进MPP+诱导的SK-N-SH细胞增殖。Caspase级联反应参与细胞凋亡过程。caspase-3是caspase级联反应的重要分子，其受到上游信号刺激被激活后产生级联效应，诱导细胞凋亡[15]。本研究显示，上调miR-30a-5p后，MPP+诱导SK-N-SH细胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白表达显著降低，提示上调miR-30a-5p可能通过抑制细胞中Cleaved-caspase-3蛋白表达降低MPP+诱导的SK-N-SH细胞凋亡。

USP22基因定位于人染色体17p11.2，由14个外显子组成，其编码蛋白表达于细胞核。研究显示，USP22在非小细胞肺癌和胃癌等肿瘤中表达升高，下调其表达可显著降低了胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力[16,17]。高糖可促进足细胞中USP22表达，上调USP22表达可明显增强高糖诱导的足细胞凋亡和炎性反应[18]。目前，USP22对MPP+诱导的SK-N-SH细胞增殖和凋亡的影响还未知。本研究显示，MPP+可促进SK-N-SH细胞中USP22的mRNA和蛋白表达，下调USP22可促进MPP+诱导的SK-N-SH细胞增殖，同时抑制细胞凋亡，提示USP22可能参与PD的发生和发展过程。

为了进一步探究上调miR-30a-5p促进MPP+诱导的SK-N-SH细胞增殖并抑制细胞凋亡的分子机制，本研究通过生物信息学软件预测显示，USP22可能是miR-30a-5p的靶基因。双荧光素酶报告基因实验结果显示，miR-30a-5p可与USP22的3’UTR靶向结合。此外，SK-N-SH细中miR-30a-5p上调后，USP22蛋白表达水平降低，而下调miR-30a-5p后，USP22蛋白表达水平升高，进一步证实了miR-30a-5p在SK-N-SH细胞中靶向负调控USP22表达。本研究还显示，上调USP22逆转了上调miR-30a-5p对MPP+诱导的SK-N-SH细胞增殖和凋亡的影响，提示上调miR-30a-5p通过靶向抑制USP22表达促进MPP+诱导的SK-N-SH细胞增殖及抑制细胞凋亡。

综上所述，MPP+可抑制SK-N-SH细胞增殖，并诱导细胞凋亡，而上调miR-30a-5p表达可促进MPP+诱导的SK-N-SH细胞增殖及降低MPP+诱导的SK-N-SH细胞凋亡，作用机制可能与下调细胞中USP22表达有关，miR-30a-5p/USP22轴可能为PD的治疗提供了潜在分子靶点。