许凌峰，黄艳萍，郭冬琴，杨 敏，张 杰，赵晶晶*，周 浓*

(1. 重庆三峡学院生物与食品工程学院/三峡库区道地药材绿色种植与深加工重庆市工程实验室，重庆 万州 404120；2. 大理大学药学与化学学院，云南 大理 671000)

【研究意义】滇重楼(Parispolyphyllavar.yunnansensis)是百合科重楼属植物，主要分布于我国西南地区，其干燥根茎为一种清热解毒名贵中药材，是“宫血宁胶囊”、“云南白药”等多种中成药的主要原料，已被2015版中国药典收载[1]。市场上的重楼药材多年以来主要依赖于野生采挖，导致野生资源几近枯竭，目前滇重楼已被列为国家重点保护野生药材濒危物种[2-3]。因此，寻找合适的滇重楼人工育苗方法显得尤为重要。【前人研究进展】丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi，AMF)是一类广泛分布于陆地生态系统中的土壤有益微生物，能与大部分植物根系形成互惠共生体[4]。研究表明，AMF可提高药用植物移栽成活率和结实率，促进寄主植物对矿质营养元素的吸收，尤其是磷元素的吸收，提高药用植物抗逆性，影响其次生代谢产物的形成等等[5-6]。共生受体样蛋白激酶基因(SYMRK)与产生钙离子振荡的通道蛋白基因(DMI1)是AMF早期共生信号途径的关键基因[7-8]，这些编码基因在水稻等经济作物中的研究报导较多，而作为濒危物种药物来源的滇重楼研究鲜见报道，菌根化的滇重楼幼苗内SYMRK和DMI1在不同种源、不同接种时期和不同采收时期中是如何变化的有待研究。【本研究切入点】滇重楼主要以根茎入药，故滇重楼根茎与AMF共生关系的研究，有利于探知影响滇重楼根茎品质的本质。本课题组先前关于接种不同AMF对滇重楼菌根侵染率、幼苗光合参数、入药品质以及功能基因表达的影响进行了初步研究[9-11]，甄选出了多种较利于滇重楼生长的AMF。【拟解决的关键问题】从前期的研究中选择了透明盾巨孢囊霉(Scutellosporapellucida)、美丽盾巨孢囊霉(Scutellosporacalospora)、球状巨孢囊霉(Gigasporamargarita)、微白巨孢囊霉(Gigasporaalbida)、玫瑰红巨孢囊霉(Gigasporarosea)、巨大巨孢囊霉(Gigasporagigantea)、亮色盾巨孢囊霉(Racocetrafulgida)、瑚状盾巨囊霉(Racocetracoralloidea)、沙荒球囊霉(Septoglomusdeserticola)、明球囊霉(Rhizophagusclarus)、根内球囊霉(Rhizophagusintraradices)、近明球囊霉(Claroideoglomusclaroideum)12种优良的单株AMF进行菌剂组合[10-11]，共计九组AMF的组合进行深入研究，采用实时荧光定量PCR技术进行幼苗须根功能基因表达量(SYMRK和DMI1)及菌根侵染率、侵染强度、琥珀酸脱氢酶(SDH)和碱性磷酸酶(ALP)活性的测定，为滇重楼高产优质栽培技术提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试丛枝菌根真菌

通过美国国际丛枝菌根真菌种质资源保藏中心(INVAM)购得纯净的AMF菌剂，在三峡库区道地药材绿色种植与深加工重庆市工程实验室(重庆三峡学院)进行菌剂的扩繁和保存，根据课题组前期的试验结果[9-11]，将筛选出来的优良单株AMF进行组合，其组合方式见表1，接种物由孢子、菌丝和菌根片段组成根际混合物。

表1 不同处理及其接种AM真菌

1.2 试验设计

采收的新鲜种子常温下河沙贮存4个月，经三峡库区道地药材绿色种植与深加工重庆市工程实验室(重庆三峡学院)周浓教授鉴定为百合科植物滇重楼Parispolyphyllavar.yunnanensis的成熟种子，种子采用单株保存的方式以保证种质资源的稳定性和均一性。依次于2013年1月和2014年1月进行播种，滇重楼种子去除外果皮后，用10%次氯酸钠溶液浸泡15 min进行消毒，再用蒸馏水冲洗4～5次备用；菜园土和河沙按照3∶1的体积比进行混合作为培养基质，置于1×105Pa灭菌2 h备用。采用温室栽培法，共设置9个菌剂处理(S1～S9)和1个对照(CK，S10)共10个处理，每个处理设置10次重复，待滇重楼出苗后每盆间苗20株，各处理每盆接种含180个孢子的混合菌剂(均分)，滇重楼幼苗生长期间定期浇Hoagland营养液。

具体的种源、育苗时期、AMF接种时期及样品采收时期见表2。收获后的滇重楼植株在冰水浴中洗净根系，采用何忠俊等[12]报道的方法，剪成1.0～1.5 cm长的根段，一部分置于FAA固定液中用于菌根侵染率和侵染强度的测定；一部分保存在液氮中用于根内碱性磷酸酶(ALP)、琥珀酸脱氢酶(SDH)活性及功能基因表达量的测定。

表2 试验设计

1.3 丛植菌根真菌的分析与评价

随机选取浸泡于FAA固定液中的滇重楼根系30条，采用Philips JM等[13]的方法染色、制片、镜检，根据Trouvelot等[14]的方法统计菌根侵染率和侵染强度。根内菌丝碱性磷酸酶、琥珀酸脱氢酶活性测定采用组织化学染色法[15-16]。

1.4 滇重楼幼苗根茎功能基因表达量的测定

总RNA提取按照SGTriEx高纯总RNA提取试剂盒说明书提取样品。取0.1 g根茎样本提取总RNA，经过纯化后合成cDNA。其过程为：RNA模板5 μg，Oligo(dT)18引物1 μL，5× Reaction Buffer 4 μL，dNTP 2 μL，RT enzyme 1 μL，加DEPC处理至20 μL后，混匀，离心，42 ℃水浴60 min，85 ℃水浴10 min，灭活逆转录酶，直接用于Real-time PCR扩增。

实时荧光定量PCR扩增：滇重楼2个功能基因(SYMRK和DMI1)及内参基因(Actin)的引物序列见表3。荧光定量PCR的反应体系为15 μL: 2×SG Green qPCR Mix 7.5 μL，上下游物引物各0.25 μL，cDNA 2 μL，nuclease-free water 6 μL。PCR反应条件为95 ℃ 10 min、95 ℃ 20 s、60 ℃ 30 s，循环40次，95 ℃ 15 s、60 ℃30 s、95 ℃15 s。每个样品每个基因3个PCR平行反应。以Actin为内参，采用比较Ct方法计算出2个功能基因的相对表达量。

1.5 数据分析

采用Microsoft Excel 2003软件进行数据整理和绘图，运用SPSS20.0及Prizm 4软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 菌根真菌与不同苗龄滇重楼共生下菌根侵染率和侵染强度的变化

由图1可见，AMF与滇重楼幼苗形成了良好的共生关系，其幼苗菌根的侵染率达到了80.00%以上，但CK未被侵染。总体上看，T2期的侵染率相对较低，其中T2期S5的侵染率最低。可见，接种外源AMF对滇重楼根系菌根侵染率具有一定的促进作用。

接种时期对滇重楼幼苗根系侵染强度的影响见图2，AMF对不同接种时期滇重楼幼苗侵染强度的影响差异显著，但CK未有侵染，各处理的侵染强度在18.85%～92.50%，其中T1期的S8侵染强度最高(92.50%)，T3期的S3侵染强度最低(18.85%)。在接种和取样时期相同时，栽培种源(T1)接种S1、S2和S3菌剂时，其AMF侵染强度显著高于野生种源(T3)，野生种源(T3)接种S7、S8和S9菌剂时，其AMF侵染强度较高。这说明栽培种源更适合接种AMF。在种源和采收时期相同，而接种时期不同时即T1、T4与T5相比，T1和T4各处理的侵染强度均高于T5，这说明在滇重楼播种或一年实生苗期接种AMF更有利于其侵染强度的增加。总体上看，不同接种时期接种不同AMF时，其菌根的侵染率与侵染强度存在差异，这说明接种AMF在人工栽培滇重楼幼苗中是可行的。总体来看，当菌种不同时，S2、S6和S7处理的菌根侵染率和侵染强度相对较高，表明这3种混合菌剂在滇重楼人工栽培上接种的效果更好。

2.2 菌根真菌与不同苗龄滇重楼共生下根内碱性磷酸酶活性的变化

由根内ALP活性和强度2个参数(图3)可知，滇重楼接种AMF对其根内的ALP影响显著，但CK未检测出ALP，各处理的ALP活性范围在9.09%～90.91%，表明菌丝具有生命力，均为活性。具有ALP活性的真菌在整个根系的发生强度不尽相同，各处理的ALP强度在1.36%～18.12%，AMF对不同接种时期滇重楼幼苗根内ALP侵染强度的影响差异显著，与CK相比，所有处理的ALP侵染强度均提高，表明外源接种AMF可提高滇重楼菌根真菌的生物学活性[17]。在接种和取样时期相同时，除接种S1、S9菌剂外，接种其余菌剂时栽培种源的ALP活性均高于野生种源。在接种时期和种源相同而取样时期不同时，即T1和T2相比，T2的ALP活性和强度均略好于T1。在种源和采收时期相同，而接种时期不同时，即T1、T4与T5相比，T4期的ALP活性和强度最大，这说明T4期接种AMF可使滇重楼根系的生命力更旺盛，而T1期和T5期的ALP活性普遍偏低。总体来看，当菌种不同时，S2、S6和S7处理的根内ALP活性较强，说明滇重楼幼苗接种这3种混合菌剂后菌丝的生命力更强些。

2.3 菌根真菌与不同苗龄滇重楼共生下根内琥珀酸脱氢酶活性的变化

本试验结果表明，不同AMF处理后滇重楼幼苗根系的检出率均到达了100%，但CK未检测到SDH，这说明所有处理的滇重楼的菌根均为活性菌丝，进一步表明了滇重楼对菌根真菌具有较强的依赖性[10]。由图4可知，具有SDH活性的真菌在整个根系的发生强度不尽相同，在接种和采收时期相同时，栽培种源的SDH活性高于野生种源，野生种源接种S7和S9菌剂时SDH活性较高，接种其余菌剂时活性菌丝数量较少，主要与播种时接种有关。各处理的SDH活性在11.25%～70.00%，而CK的滇重楼幼苗根系均无SDH活性，其中T5期的S8处理活性最低，为11.25%，T2期的S8处理活性最高为70.00%，可见，外源接种AMF促进了滇重楼菌根的生命力活动，与冯海艳等[16]对玉米接种AM真菌的研究结果一致。在接种时期和种源相同，采收时期不同时，即T1和T2相比，T1和T2的SDH活性和强度未有显著差异。在种源和采收时期相同，而接种时期不同时，即T1、T4与T5相比，T1和T4期的SDH活性和强度较大，而T5期的SDH活性和强度普遍偏低。总体来看，当菌种不同时，S2、S6和S7处理的根内SDH活性较强，说明滇重楼接种这3种混合菌剂更有利于提高其菌丝的生命力。

2.4 菌根真菌与不同苗龄滇重楼共生下幼苗SYMRK基因表达量的变化

由图5可知，在播种和采收时期相同时，栽培种源与野生种源相比，即T1与T3相比，除S3、S4和S9处理外，野生种源幼苗的SYMRK基因相对表达量较高，其中T3期S6的表达量最高，与CK相比，存在极显著差异。在种源和播种时期相同时，采收时期不同，即T1与T2相比，T2期部分处理SYMRK基因的相对表达量较高，其中，T2期S5增长最为明显；但部分处理出现该基因表达量下降的趋势，其中T2期S9下降最为明显。在接种时期不同，种源和采收时期相同时，即T1、T4与T5相比，T4期各处理SYMRK基因的相对表达量总体较高，而T5期次之，T1期的各处理该基因相对表达量最小。总体来看，当菌种不同时，S3、S5和S6处理更有利于根内SYMRK基因相对表达量的增加。

2.5 菌根真菌与不同苗龄滇重楼共生下幼苗DMI1基因表达量的变化

由图6可知，在接种和采收时期相同时，栽培种源与野生种源相比，即T1与T3相比，除S4和S7处理外，野生种源的各处理DMI1基因的相对表达量均高于栽培种源，其中S2处理的基因表达量最高，与CK相比，存在极显著差异。在种源和播种时期相同时，采收时期不同，即T1与T2相比，部分处理DMI1基因的相对表达量增加，其中，T2期的S7增长最为明显，但部分处理出现该基因表达量下降的趋势，其中T2期的S4下降最为明显。在种源和采收时期相同而接种时期不同时，即T1、T4与T5相比，T4期的各处理DMI1基因的相对表达量总体较高，其中，T4期S1的DMI1基因相对表达量最大，而T1期次之，T5期的各处理该基因相对表达量最小。总体来看，当菌种不同时，S5、S6和S9处理更有利于根内DMI1基因相对表达量的增加。

2.6 菌根真菌与不同苗龄滇重楼共生下功能基因表达与生长发育情况的关系

综合图1～6结果，对S6处理方式的滇重楼功能基因表达和生长发育情况的相关性进行分析(图7)。栽培种源与野生种源相比，即T1与T3相比，野生种源的滇重楼菌根侵染强度较差，根内ALP与SDH活性较低，而SYMRK和DMI1基因的相对表达量较大，植物基因的相对表达量除受自身遗传因素影响外，还受外界环境因素的影响，外源接种AMF虽然促进了野生滇重楼根内SYMRK和DMI1基因的相对表达量增加，但其侵染强度较差，这说明野生滇重楼不适宜接种AMF，对于AMF与野生滇重楼的共生效应还需深入研究。T1与T2期比较表明，当种源和接种时期相同，采收时期延长时，滇重楼侵染强度、ALP与SDH活性有所增加，SYMRK基因的相对表达量增加，而DMI1略微下降，说明功能基因表达量与生长发育情况存在一定的联系。当接种时期不同，但种源和采收时期相同时，即T1、T4与T5相比，T4期的各指标总体较高，说明T4期接种AMF的滇重楼生物活性较佳。

3 讨 论

野生滇重楼的资源几近枯竭，而重楼生长较为缓慢，存在育苗困难和种植周期较长等问题，影响了其商品化种植和品质的提升。因此，寻找出滇重楼的优势菌株，对于提高滇重楼的品质及后续大规模的种植滇重楼以满足市场需求显得十分重要。菌根化的侵染率和侵染强度及根内ALP活性和SDH活性，通常被用来分析菌根真菌对宿主植物的侵染过程及其对宿主植物生长发育的贡献率。本研究结果表明，外源接种AMF可与滇重楼幼苗根系形成良好的共生关系，但滇重楼对不同AMF选择性不同，侵染率和侵染强度差异较大，这与周浓等[10]、张华等[11]及杨光等[18]通过对药用植物与丛枝菌根真菌的选择性侵染研究结果相同。SDH是标志菌根真菌活性大小或菌根生活力的一种酶；ALP与菌丝吸收磷有关，可以直接反映丛枝菌根真菌对宿主植物有效性。与未接种株相比，菌根化滇重楼的ALP活性和SDH活性增强，这说明外源接种AMF与滇重楼根茎形成了状态良好的菌根，滇重楼幼苗对AMF有着较强的依赖性，人工栽培过程种外源接种AMF可提高滇重楼幼苗的生命活力。

共生受体样激酶(SYMRK)是定位于细胞膜上的跨膜蛋白，它对于植物感知菌根真菌并传递共生信号中扮演着重要的角色；产生钙离子振荡的通道蛋白基因(DMI1)位于细胞核中，对核区内的离子传导起到重要的作用[8,11]，这两个基因所编码的蛋白对于植物感知和接受AMF的早期信号途径是十分重要的。与CK相比，各处理的SYMRK和DMI1基因的相对表达量都有所增加，可见AMF感染植物后诱导了共生基因的表达，这说明滇重楼幼苗根系在一定程度上受到了AMF的侵染。通过测定滇重楼菌根内SYMRK和DMI1基因的表达量发现，野生种源的滇重楼菌根侵染强度以及根内ALP与SDH活性较低，这说明与栽培种源相比，野生滇重楼不适宜接种AMF，但野生滇重楼根内的SYMRK和DMI1基因的相对表达量较大，这说明野生滇重楼根系更易与AMF形成共生关系，植物基因的相对表达量除受自身遗传因素影响外，还受外界环境因素的影响，对于AMF与野生滇重楼的共生效应还需深入研究。当种源和接种时期相同，采收时期延长时，SYMRK基因的相对表达量增加较为明显，而DMI1基因相对表达量基本不变；种源和接种时期不同但采收时期相同时，与CK相比，各处理的基因相对表达量均高于CK，但2个基因的相对表达量存在差异，这说明滇重楼与AMF的共生受到多重因素的影响，选择适宜的种源，在适宜的时期接种AMF能一定程度上促进菌根的繁殖力和生命力，为滇重楼幼苗的生长发育奠定基础。

通过对滇重楼菌根的侵染率和侵染强度，以及根内ALP活性和SDH活性的监测，结合SYMRK和DMI1两个基因表达量的测定，发现在人工栽培滇重楼的过程中，外源接种AMF可使滇重楼朝向有利于其生长发育的方向发展，最佳方案应该是在栽培种源2年生苗期接种S6型混合菌剂，这为引种培育出高品质的滇重楼提供了新的思路。

4 结 论

外源接种AMF可以与滇重楼幼苗形成良好的共生关系，使幼苗菌根的侵染率达到80.00%以上，其中，由Gigasporamargarita、Gigasporagigantea、Scutellosporacalospora等6种AMF组成的S6型混合菌剂的各指标总体较高，在滇重楼2年生苗(T4时期)接种时，幼苗根茎内的ALP和SDH活性，以及SYMRK和DMI1基因相对表达量最高，滇重楼的生物活性较佳。故本实验条件下，人工栽培滇重楼过程中接种AMF的最佳方案是在栽培种源2年生苗期接种S6型混合菌剂，这为引种培育出高品质的滇重楼提供了新的思路。