赵秀平, 李国瑞, 王 双, 闫星伊, 段 强, 张 帅, 风 兰, 韩雯毓, 孙佳欣, 陈永胜

(内蒙古民族大学生命科学与食品学院, 内蒙古自治区高校蓖麻产业工程技术研究中心, 内蒙古自治区蓖麻育种重点实验室, 内蒙古自治区蓖麻产业协同创新中心, 蓖麻产业技术创新内蒙古自治区工程研究中心, 内蒙古 通辽 028043)

【研究意义】稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)是可寄生在包括水稻、小麦、小米等多种经济作物在内的50多种禾本科植物上的一种丝状子囊菌，可引发植株患稻瘟病，导致作物大幅度减产，严重影响作物品质和产量[1-2]。其因具有典型的丝状病菌特征，已被作为研究丝状病菌的模式生物[3]。MSP1(MagnaportheoryzaeSnodProt1 )是稻瘟病菌MGG-05344基因编码的与稻瘟病菌的植物毒性相关的SnodProt1蛋白。Jeong Jun Seop等人的研究表明，MSP1的突变不改变稻瘟病菌的表型，但会导致稻瘟病菌的毒性显著降低，这是首次表明该蛋白与植物毒性相关[4]。【前人研究进展】Snodprot1，首次于小麦病原体中鉴定，是真菌特异性小分泌蛋白家族的成员，该家族成员均具有植物毒性[5-6]。Cerato-platanin是Snodprot1的同系物，该家族蛋白(Cerato-platanin family proteins, CPPs)只存在于真菌中。CPPs主要编码105～134个氨基酸，含有1个14～18个氨基酸残基的信号肽，含有可形成2个二硫键的4个半胱氨酸，使其不仅可靶向运输，还耐高温和酸性条件[7-9]。其生物学功能尚不明确，可能在真菌生长和发育的不同时期发挥作用，有研究表明，其与菌丝生长或孢子形成有关；其可在植物细胞壁或植物定殖中发挥作用；与毒性相关；可刺激植物免疫系统，诱发保护机制等等[10]。【本研究切入点】本研究对MSP1的一般理化性质、结构、磷酸位点等基本属性进行了生物信息学分析，成功构建了原核表达载体pETSUMO-MSP1，对其进行诱导表达，并通过镍离子亲和层析、阴离子交换层析以及分子筛层析等纯化方法对其进行纯化。【拟解决的关键问题】最终获得大量高纯蛋白，旨在为后续进一步探索该蛋白的功能、互作蛋白分析、作用机理以及信号转导途径等研究提供一定的理论与实践依据。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究使用的MSP1的氨基酸序列，来自NCBI数据库XP_003710181.1；大肠杆菌表达载体pETSUMO_1b，实验室提供；大肠杆菌克隆菌株DH5(及表达菌株E.coliBL21(DE3)的感受态细胞，北京庄盟国际生物科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 MSP1的生物信息学分析 利用ExPASy-ProtParam和Prot Scale工具分别分析MSP1的一般理化性质及亲疏水性[11-13]；使用NCBI BLAST和NetPhos 3.1分别分析MSP1的保守结构域和磷酸化位点[14-15]；在Pfam数据库中分析该蛋白所在家族成员[16]；使用工具TMHmmol/L和ExPASy Prosite分别预测MSP1跨膜结构域和结构功能位点[17-19]；使用在线工具Phobius和Signal P预测MSP1的信

号肽位点[20]；使用在线工具SOPM和Phyre 2 预测MSP1的二级和三级结构[21-23]。软件详细网址及对应分析功能如表1所示。

表1 生物信息学分析软件表

1.2.2 pETSUMO_1b-MSP1蛋白的构建 根据KEGG数据库提供的MSP1(MGG-05344)基因序列去除信号肽序列后设计引物，克隆MSP1(MGG-05344)基因；使用双酶切法和Sticky-End法对MSP1(MGG-05344)基因和表达载体pETSUMO_1b进行切割和重新连接，构建重组表达载体pETSUMO_1b-MSP1，热激转化至大肠杆菌克隆菌株DH5α，通过PCR扩增检测将阳性质粒测序，测序正确后用于后续试验[1]。

1.2.3 pETSUMO_1b-MSP1蛋白表达与纯化 将重组蛋白pETSUMO_1b-MSP1热激转化至菌株E.coliBL21(DE3)中。在含100 μg/mL Amp(氨苄青霉素)的LB液体培养基中37 ℃、220 r·min-1振摇8 h，培养至OD600为0.5～0.6。分别以0.1和0.3 mmol/L IPTG作为诱导剂，在18 ℃、180 r·min-1诱导20 h或37 ℃、180 r·min-1诱导10 h后收集菌体[24-25]。加入缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，500 mmol/L NaCl，20 mmol/L 咪唑)超声裂解菌体重悬液，将得到的蛋白粗提液经15 000 r·min-1高速离心后，取上清液过Ni+亲和柱，并加入20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，咪唑浓度梯度为40～200 mmol/L(40、80、100、200 mmol/L)的缓冲液洗脱结合蛋白，将含有大量蛋白的咪唑洗脱液使用截留分子量为10 KD的浓缩管进行适当浓缩[26-27]。将纯化后的蛋白进行脱盐处理，脱盐缓冲液为20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0。根据pETSUMO_1b-MSP1的理论等电点(5.3)，选用ResourceTMQ层析柱，A泵和B泵缓冲液分别为：20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0；20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，1.0 M NaCl进行离子交换层析，纯化后浓缩洗脱液[28]。选用GE superdexTM200 10/300GL层析柱，使用缓冲液20 mmol/L Tris-Hcl，pH 8.0，150 mmol/L NaCl进行分子筛层析[29]。将高含量洗脱液使用10 KD浓缩管浓缩至10 mg·mL-1,存放于-20 ℃备用。上述操作结束后均使用SDS-PAGE检测洗脱液中重组蛋白含量。

2 结果与分析

2.1 MSP1的生物信息学结果分析

2.1.1 一般理化性质分析 MSP1的一般理化性质结果显示，该蛋白的分子式为C617H955N173O201S6，总原子数为1952，分子量为14 204.77 Da(约14.2 KD)，理论等电点为4.6，平均亲和性与不稳定指数分别为0.032和41.32。因此，该蛋白为不稳定性疏水蛋白，与在线软件Prot Scale的预测结果(图1)相似。

2.1.2 MSP1的保守结构域及功能位点分析 MSP1的保守结构域分析结果如图2所示，此蛋白存在Cerato-platanin结构域，属于Cerato-platanin家族成员。功能位点分析结果显示该蛋白无功能位点。

2.1.3 MSP1的跨膜结构域、信号肽及磷酸化位点分析 MSP1的跨膜结构域和信号肽预测结果如图3～4所示，此蛋白质不含跨膜结构域，在N端含一

段信号肽，为氨基酸序列1～18位，与Signal P预测结果一致。此结果表明，该蛋白不属于膜蛋白，属于非典型分泌蛋白，推测其具有运输功能。磷酸化位点预测结果如图5所示，该蛋白共存在11个磷酸化位点，分别是位于第25、48、54、80和85位的苏氨酸(Thr)位点，位于第31、38、40、119和127位的丝氨酸(Ser)位点和第27位的酪氨酸(Tyr)位点。

2.1.4 MSP1的结构分析 MSP1由137个共20种常见氨基酸组成。其二级结构和三级结构分别如图6～7所示，其中，二级结构包含α-螺旋(Hh)、延伸链(Ee)、β-转角(Tt)和无规卷曲(Cc)，数量分别为33、42、14和48，各占比24.09%、30.66%、10.22%和35.04%。

2.2 pETSUMO-MSP1蛋白表达与纯化结果分析

2.2.1 pETSUMO-MSP1的诱导表达 本研究在诱导重组蛋白表达的过程中为最大程度获得重组蛋白，进行了诱导温度以及诱导剂浓度的筛选试验。结果表明，当诱导温度为18或37 ℃时，均可诱导重组蛋白表达，但18 ℃诱导20 h比37 ℃诱导10 h的诱导表达量要高。当诱导剂IPTG的浓度为0.3 mmol/L时可诱导重组蛋白表达，而浓度为0.1 mmol/L时诱导表达不明显。因此，使用0.3 mmol/LIPTG作为诱导剂，诱导条件为18 ℃ 20 h可较好的诱导重组蛋白表达，即以此为后续纯化试验所用的蛋白诱导表达条件。

2.2.2 镍离子亲和层析 亲和层析电泳检测结果如图8所示，当咪唑浓度为40、80、100和200 mmol/L时均可洗脱重组蛋白，但在咪唑浓度为80和100 mmol/L时洗脱的蛋白含量更高且无明显差异，因此，亲和层析缓冲液的最适咪唑浓度为80或100 mmol/L。由于亲和层析后电泳图中可见明显杂带，因此，需要进一步纯化。

2.2.3 阴离子交换层析 蛋白脱盐处理和阴离子交换层析的结果如图9所示，在脱盐穿出液B液和C液中均可检测到重组蛋白，B液中含量较高，因此使用B液进行进一步纯化。纯化结果显示，该蛋白呈现双洗脱峰，分散性较好，带电性质较均一，主峰在16.04 mS/cm且表现出对低盐条件的耐受性。SDS-PAGE电泳检测结果显示，洗脱液D液和F液均可检测到大量重组蛋白，其中，D液较F液的蛋白含量高，且F液存在杂带，表明可能存在杂蛋白，仍需进一步纯化分析。

2.2.4 分子筛层析 分子筛结果如图10所示，该蛋白具单一洗脱峰，对称性良好，最大峰出峰位置为17.1 mL，分子量约为20 KD，结合SDS-PAGE电泳检测结果，洗脱液C液和D液中均可检测到大量重组蛋白，且均无杂带，电泳条带均出现在约20 KD，表明该蛋白极有可能以单体的形式存在，且已成功纯化并得到该重组蛋白。

3 讨 论

稻瘟病是最具迫害性的病害之一，可使禾本科作物减产，严重时可造成绝产[30-32]。多年来，对CPPs展开了大量的研究，虽然多数研究表明缺乏CPPs的菌株表型与野生型无显著差异，但仍有研究表明CPPs在真菌整个生长和发育的不同阶段发挥作用。如，核盘菌缺失CP1/Sm1引发菌核和菌丝生长异常、感染力降低等现象[33]；球孢白僵菌缺失CgCP1(炭疽病菌)虽然菌丝生长正常，但会使减少分生孢子数[34]；稻瘟病菌缺失MSP1会导致毒性降低[4]；核盘菌的CP1/Sm1可与PR1相互作用，通过抑制PR1的抗真菌活性提高真菌的毒性等[35]。本研究得到的MSP1的生物信息学分析结果与Jeong Jun Seop等人的研究结果相符，如分子量大小、亲疏水性及蛋白家族等。在UNIPROT数据库中查询到该蛋白存在两个互作蛋白MGG-06538(Bys1 family protein)和MGG-08622(Nucleoside diphosphate kinase)，但在KEGG数据库中未查询到该蛋白参与的信号转导通路，表明该蛋白的作用机制还尚未明确，因此，表达纯化MSP1对于后续研究该蛋白的具体功能以及作用机制具有重要意义。

本研究最终得到大量MSP1高纯蛋白，可供后续分析该蛋白的功能使用。在后续研究中设计如下研究方案：①利用Pull down技术筛选和鉴定该蛋白的互作蛋白并分析互作关系；②使用酵母双杂交和等温滴定量热法分析互作蛋白功能；③设计该蛋白的晶体生长试验，进一步探索该蛋白的结构和功能。关于MSP1我们已经掌握的信息还很少，暂时无法解释其所具有的功能以及如何影响毒力，因此，还需要大量的试验去探索该蛋白的功能、作用机理等一系列问题。

4 结 论

本研究通过对MSP1进行生物信息学分析，预测到该蛋白的分子量约为14.2 KD，由137个氨基酸组成，等电点为4.6，属于Cerato-platanin家族成员。该蛋白N端1～19位氨基酸构成信号肽序列，无跨膜结构，属于非典型分泌蛋白，存在11个磷酸化活性位点，分别是5个苏氨酸位点、5个丝氨酸位点和1个酪氨酸位点。二级结构由延伸链、α-螺旋、β-转角和无规卷曲构成。诱导该蛋白表达的最适条件为0.3 mmol/L IPTG，18 ℃，180 r·min-1，20 h。镍离子亲和层析的最适缓冲液为20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，80 mmol/L、100 mmol/L咪唑。阴离子交换层析表明该蛋白耐低盐条件。分子筛层析具单一峰，出峰位置为17.1 mL，分子量约20 KD，缓冲液为20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，150 mmol/L NaCl，推测该蛋白以单体形式存在。本研究最终成功纯化大量重组蛋白，可为进一步探索MSP1的晶体结构、功能以及分析互作蛋白完善相应的信号转导通路奠定一定的理论与实践基础。