何雪梅，唐雅园，孙 健，李 丽，向 昱，杨兆杏，赵承刚，韦 珍，唐 杰*

(1.广西农业科学院农产品加工研究所，广西 南宁 530007； 2.广西果蔬贮藏与加工新技术重点实验室，广西 南宁 530007；3.广西香蕉保鲜与加工工程技术研究中心，广西 南宁 530007；4. 河池市农业技术推广站，广西 河池 547000)

【研究意义】磷脂酶D(PLD)即磷脂酰胆碱磷脂水解酶(EC3.l.4.4)，是植物组织中普遍存在的一类水解酶，能催化水解磷脂末端的磷酸二酯键生成磷脂酸(PA)和亲水性胆碱等，在保持细胞膜基本结构与生理功能方面具有重要调控作用，其在植物种子萌发、器官衰老及逆境胁迫中的作用已成为研究热点[1-2]。香蕉为芭蕉科(Musaceae)芭蕉属(Musa)单子叶植物，也是全球鲜销量最大的水果品种之一[3]，其果实在采收与运输过程中冷害、病害及机械伤等造成的损失相当严重，其中我国香蕉采后损耗率在30%以上[4]。已有研究表明，香蕉PLD对香蕉衰老劣变和采后逆境发挥着重要的调控作用[5]。因此，建立香蕉PLD的分离纯化方法并分析其生化特性，对系统研究香蕉PLD在香蕉采后贮运保鲜中的作用具有重要意义。【前人研究进展】目前，有关香蕉PLD的研究主要集中于PLD基因克隆和表达在香蕉冷害、机械伤等逆境胁迫中的作用等方面。Li等[5]通过RT-PCR方法获得PLDα(MaPLDα)基因，并分析其基因序列，发现MaPLDα mRNA和PLD活性在发育旺盛的组织(叶片、花和茎)中表达量较高，低温能激发香蕉MaPLDα基因表达，说明MaPLDα基因表达与香蕉的低温抗性有一定关系。He等[6]的研究也证实低温能激发香蕉PLD活性，延长贮藏期。损伤果实中PLDmRNA的表达量是未损伤果实的2.67倍，同时脂氧合酶活性升高、丙二醛(MDA)生成加快，抗氧化酶活性均显著高于未损伤果实[7]。PLD是细胞膜磷脂水解的关键酶，可催化磷脂生成磷脂酸和胆碱，引起细胞膜损伤和膜透性增加，导致膜功能丧失，加速果实衰老劣变[8]。货架期香蕉果实的PLD活性较贮藏初期显著提高，正己醛(1种PLD抑制剂)可通过抑制PLD活性以延长香蕉货架期，也可通过保持果皮和果肉细胞的结构完整性延缓成熟过程，提高贮藏品质，延长贮藏期[9]。随着采后龙眼贮藏时间的延长，果实中PLD等膜脂水解酶活性升高，水解产物含量增加，膜透性增大，而喷施胺鲜酯可降低PLD等膜脂水解酶活性，延缓果实衰老[10]。许佳妮等[11]研究证实，橙油处理致柑橘果实油胞病发生，病程中PLD活性显著升高，导致细胞膜水解加剧，促使油胞病发生并加剧油胞病症状。【本研究切入点】PLD在果蔬采后逆境胁迫中发挥着重要作用，但目前针对香蕉PLD的研究多集中在香蕉的PLD基因克隆与表达方面，分离纯化出香蕉PLD并明确其生理生化特性的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】提取香蕉PLD并对其进行分离纯化，分析其生化特性，优化香蕉PLD活性测定的最佳条件，为香蕉PLD的深入研究打下基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试香蕉品种为桂蕉6号，于2019年9月27日采摘自广西南宁市坛洛镇果园，当天运至广西农业科学院，挑选成熟期一致、大小均一、无机械伤害的果实为试验材料。

仪器与试剂：Beckman J-301高速冷冻离心机(德国BECKMAN公司)，BioTek Epoch全波长酶标仪(美国BioTek公司)，LC-16高效液相色谱仪(日本SHIMADZU公司)，磷脂酰胆碱(PC)、二甲基戊二酸(DMG)、辣根过氧化酶(HRP)、胆碱氧化酶、亚油酸(美国Sigma公司)，50%胆碱水溶液(中国安谱科学仪器有限公司)，其他常规化学试剂为国产分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 香蕉PLD提取 香蕉置于匀浆机中，加入预冷的HEPES缓冲液(含0.32 mol/L蔗糖、1.0 mmol/L二硫代苏糖醇、1.0 mmol/L苯甲基磺酰氟和1.0 mmol/L EGTA，pH 7.0)制成10%匀浆，匀浆液过4层纱布后3000 r/min离心15 min，上清液经15 000 r/min离心25 min，再以105 000 r/min超速离心1 h后，沉淀部分为微粒体膜蛋白，该蛋白包括细胞质膜、内质网膜和液泡膜。沉淀溶于100.0 mmol/L pH 6.5的DMG，即得PLD粗酶提取液，冻干备用。所有提取步骤均在4 ℃下进行。

1.2.2 香蕉PLD活性测定 参考张红宇等[12]的方法采用酶联比色法测定香蕉PLD活性，稍加修改。 取PLD酶液(空白组由DMG替代) 30 μg，加入200.0 μL反应系中，其中含100 mmol/L DMG(pH 6.5)、10 mmol/L CaCl2、1 mmol/L MgCl2和5 mmol/L亚油酸，加入12 mmol/L PC后在30 ℃下孵育30 min，8 min沸水浴终止反应。冷却后加入含45 mmol/L(pH 8.0)Tris-HCl、0.8单位胆碱氧化酶、2.4单位HRP、0.24 mg 4-ATT和0.16 mg重蒸酚显色液0.8 mL，30 ℃下反应90 min，最后加入1.0 mL含2 g/L Triton X-100的Tris-HCl(pH 8.0)，混合液经0.22 μm孔径滤膜滤除杂蛋白，于500 nm下测定OD值。以Bradford比色法测定可溶性蛋白含量，PLD活性以nmol/(min·mg)蛋白表示。

1.2.3 香蕉PLD纯化 分别采用硫酸铵沉淀和柱层析法对粗酶液进行纯化[13-14]。将粗酶液50.00 mg分别加入1.0 mL不同浓度(50%、60%、70%、80%和90%)硫酸铵溶液中，4 ℃ 静置 2 h 后，10 000 r/min离心10 min，收集沉淀并用缓冲液悬浮，测定沉淀中的PLD活性以确定硫酸铵沉淀条件。

筛选的高活性酶液经GE系列的PD-10脱盐柱除盐。脱盐后的酶液上Hitrap SP HP阳离子交换柱，用含1.0 mol/L NaCl的柠檬酸—柠檬酸钠缓冲液(50.0 mmol/L，pH 5.0) 进行梯度洗脱，根据酶活测定结果筛选高活力洗脱液，浓缩后上Sephadex G-200凝胶层析柱，用含0.5 mol/L NaCl 的柠檬酸—柠檬酸钠缓冲液(50.0 mmol/L，pH 5.0) 洗脱，收集高PLD活力洗脱液。纯化后的酶液经高效液相检测纯度，色谱条件为：色谱柱TSK-GEL凝胶色谱柱(7.8 mm×300 mm，10 μm)，检测波长215 nm，流动相为磷酸盐缓冲液(0.2 mmol/L，pH 6.5)，流速0.5 mL/min。

1.2.4 香蕉PLD生化特性与酶动力学分析 参考夏禹等[13]的方法考察反应体系中不同蛋白含量(0.00～50.00 μg)、Ca2+浓度(0～1.40 mmol/L)反应时间(0～35.00 min)和pH(5.0～8.0)对PLD活性的影响；参考杨宁等[15]的方法，在适宜的pH条件下测定香蕉PLD在不同底物浓度(PC，0～1.2 mmol/L)下的反应速率，建立酶动力学方程，分析香蕉PLD的酶动力学特性，确定香蕉PLD活性的最佳测定条件。

1.3 统计分析

试验数据采用SPSS 13.0进行统计，以Duncan，s新复极差法进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 香蕉PLD的分离纯化结果

2.1.1 不同浓度硫酸铵对PLD的初步纯化效果 由表1可知，随着硫酸铵浓度的增加，蛋白沉淀量不断增大，PLD活性呈现先升高后降低的变化趋势，说明在适宜的蛋白含量下PLD活性最强；当硫酸铵浓度为80%时，回收的PLD活性最高，回收率最高，分别达24.05 nmol/(min·mg)和73.89%；当硫酸铵浓度大于80%时，PLD活性及其纯化倍数降低，说明此时的硫酸铵浓度有利于其他杂蛋白沉淀，杂蛋白含量增多，沉淀中酶的活性也有缓慢降低趋势。因此，确定香蕉PLD初步纯化效果最佳的硫酸铵浓度为80%。

表1 不同浓度硫酸铵对香蕉PLD纯化的影响

2.1.2 柱层析对香蕉PLD的纯化效果 经80%硫酸铵溶液沉淀后的酶液经脱盐后，分别过DEAE-sepharose CL-6B阴离子交换柱、Hitrap SP HP阳离子交换柱和Sephadex G-200凝胶层析柱，进一步除去杂质后测定蛋白含量和酶活性，考察不同层析柱对香蕉PLD的纯化效果，结果(表2)表明，经DEAE-sepharose CL-6B阴离子交换柱纯化层析，香蕉PLD纯化了13.70倍，酶活性达94.15 nmol/(min·mg)；经Hitrap SP HP阳离子交换柱纯化层析，香蕉PLD纯化了22.96倍，酶活性达157.76 nmol/(min·mg)；经Sephadex G-200凝胶层析柱进一步纯化层析，香蕉PLD纯化了58.74倍，酶回收率虽仅为11.57%，但酶活性达403.55 nmol/(min·mg)。说明硫酸铵沉淀结合柱层析法对香蕉PLD粗酶液的纯化效果极佳，该方法适用于香蕉PLD纯化。

表2 柱层析对香蕉PLD的纯化效果

将纯化后的香蕉PLD经高效液相色谱(HPLC)进行检测分析，可见HPLC色谱图显示香蕉PLD为单一峰(图1)，表明该酶液纯度较高，经SDS-PAGE测定，显示为单一条带，表示酶液为电泳纯，香蕉PLD的相对分子量约为43 kD。香蕉PLD的纯化为进一步研究香蕉PLD的特性打下了物质基础。

2.2 香蕉PLD的生化特性

2.2.1 不同蛋白含量对香蕉PLD活性的影响 测定不同香蕉PLD蛋白含量条件下的香蕉PLD活性发现(图2)，在0～30.00 μg蛋白含量下，PLD活性随着反应体系中蛋白含量的增加呈逐渐升高趋势，当蛋白含量达30.00 μg时PLD活性达峰值，且显著高于其他蛋白含量时的PLD活性(P<0.05，下同)，随后随着蛋白含量的增加呈降低趋势。因此，确定在香蕉PLD活性测定体系中蛋白含量以30.00 μg为宜。

2.2.2 不同Ca2+浓度对PLD活性的影响 从图3可看出，反应体系中不同Ca2+浓度下，香蕉PLD活性呈先升高后降低的变化趋势。其中，在0～1.20 mmol/L区间，PLD活性呈波动升高，当Ca2+浓度为1.20 mmol/L时PLD活性达最高值，为672.13 nmol/(min·mg)，且显著高于除Ca2+浓度为1.00 mmol/L外的PLD活性，说明在香蕉PLD活性测定体系中Ca2+浓度以1.20 mmol/L为宜。

2.2.3 不同反应时间对香蕉PLD活性的影响 从图4可看出，随着反应时间的延长，香蕉PLD活性表现出先迅速升高后缓慢降低的变化趋势。在起始的10.00 min内，PLD活性快速升高，反应15.00 min时PLD活性达峰值，且显著高于除反应10.00 min外的PLD活性，随后波动下降。说明在香蕉PLD活性测定体系中测定时间以15.00 min为宜。

2.2.4 不同pH对香蕉PLD活性的影响 从图5可看出，反应体系pH为5.0～6.5时，香蕉PLD活性总体上呈升高变化趋势，pH为6.5时香蕉PLD活性最高，且显著高于其他pH条件，当pH大于6.5时，PLD活性急剧降低。因此，确定香蕉PLD活性测定体系中pH以6.5为宜。

2.3 香蕉PLD的酶动力学特性

从图6可看出，在pH为6.5条件下，以1/[s]为横坐标、1/V为纵坐标作Lineweaver-Burk双倒数图，得到方程式l/V=16.034/[s]+9.5145(R2=0.998，其中V表示反应速度，[s]为底物浓度)。

继续根据方程式求该香蕉PLD催化不同浓度底物的Km和Vmax(其中Km为米氏常数，是反应速度达到Vm一半时的底物浓度；Vmax表示底物饱和时的反应速度)，分别为2.31 mmol/L和39.04 nmol/min，Vmax/Km为16.90，说明香蕉PLD亲和力强，具有较高的催化活性。

3 讨 论

早在1947年，科学家已从胡萝卜和白菜叶中提取到有活性的PLD[16]，但PLD类型丰富多样，且对其生化与酶学特性的了解甚少，直至1994年Wang等[17]从萌发的蓖麻种子中提取、纯化得到有活性的PLD，并成功克隆蓖麻子PLD基因，才拉开了PLD功能研究与利用的序幕。Novotn等[18]研究显示，油菜籽PLD经硫酸铵沉淀、Octyl-Sepharose CL-4B层析、PAPG电泳后，酶被纯化了703倍，酶活性达713.97 nmol/(min·mg)。Simkhada等[14]依次采用硫酸铵沉淀、Sepharose CL-6B凝胶柱、DEAE-sepharose CL-6B column离子交换柱和Sepharose CL-6B凝胶柱层析对产自Streptomycessp. CS684的PLD进行纯化后使其达到电泳纯，分子量为29 kD。胡博新等[19]利用硫酸铵沉淀、阴离子色谱柱DEAE-sepharose、阳离子色谱柱 Source30s和凝胶过滤色谱柱Superdex G 75纯化链霉菌PLD，PLD被纯化了474倍并达到电泳纯，酶活力达379 U/mg，分子量为57 kD。本研究在参考前人分离纯化方法的基础上，筛选适宜的香蕉PLD分离技术，优化硫酸铵溶液沉淀浓度为80%，再依次经过DEAE-sepharose CL-6B阴离子交换柱、Hitrap SP HP阳离子交换柱和Sephadex G-200凝胶层析柱纯化后，香蕉PLD纯化了58.74倍，酶回收率虽仅为11.57%，但酶活性达403.55 nmol/(min·mg)，纯化后的香蕉PLD分子量为43 kD，与迄今检测到的PLD分子量在22～330 kD之间(大部分介于75～125 kD之间)[20-21]存在差异，可能与测定方法不同有关。

不同来源PLD的生化特性存在差异，影响PLD催化反应的因素很多，如盐浓度特别是Ca2+浓度、反应时间和底物浓度等。Ca2+浓度对PLD尤其是植物源的PLD影响最显著，除拟南芥PLD家族中的PLD ζ外，其他植物PLD均需要一定的Ca2+浓度才能达到最强活性。PLDα是PLD家族中受Ca2+影响最大的成员，在体外达到最强活力时需Ca2+催化[22]，当Ca2+浓度在0～200.0 μmol/L时，PLD基本无活性，只有在高于200.0 μmol/L时，PLD才表现强活性。对甘蓝、芥菜和桃等PLD的研究均已证实，PLD活性受Ca2+调控[2，12，15]。PLD C2区的存在是Ca2+激活的结构基础，信号转导蛋白和膜运输蛋白(PKC、PLC和PLA2)中都存在C2区，因此有必要对细胞膜上Ca2+调控的蛋白进行翻译[23-25]。但不同PLD所需Ca2+浓度不同，本研究中，香蕉PLD活性达最高值时的Ca2+浓度为1.20 mmol/L，与桃PLD达最强活性所需的Ca2+浓度为10.00 mmol/L，高山离子芥达最强活性所需的Ca2+浓度为0.80 mmol/L[12，15]差异较明显。对比以往文献[15，20，26]报道发现，本研究中香蕉PLD反应速度快于高山离子芥PLD(反应30.00 min活性达峰值)，但比草莓和玉米PLD反应速度慢，草莓PLD在反应后10.00 min达峰值，而玉米PLD在反应后2.50 min即达峰值；蛋白含量对香蕉PLD活性的影响趋势与草莓、桃和高山离子芥等一致[12，15，20]，均有一个峰值，即在适宜的蛋白含量条件下，PLD活性最强。因此，考察不同因素对PLD反应的影响，优化PLD检测的最佳条件，明确其生化特性及酶动力学特性，对后续研究香蕉PLD在果实生长发育与采后贮藏中的调控机制非常必要。

4 结 论

80%硫酸铵沉淀结合DEAE-sepharose CL-6B阴离子交换柱、Hitrap SP HP阳离子交换柱和Sephadex G-200凝胶层析柱适用于香蕉PLD纯化，蛋白含量30.00 μg、Ca2+浓度1.20 mmol/L、反应时间15.00 min和pH 6.5可作为优化的香蕉PLD活性测定最佳条件。