韦丽君，俞奔驰，宋恩亮，檀小辉，郑 华，周时艺，文 峰，卢赛清，付海天

(广西壮族自治区亚热带作物研究所，广西 南宁 530001)

【研究意义】木薯可用于生产变性淀粉、淀粉糖和乙醇等涉及国计民生各领域的3000多种产品[1]。我国木薯原料生产严重不足，木薯贸易以进口鲜木薯、木薯淀粉和木薯干为主，年进口数量约1045.90万t，进口金额约22.20亿美元，是世界上最大的木薯进口国[2]。随着木薯品种退化和病虫害日益严重，我国木薯原料生产又遭遇了新的挑战，选育出适应市场需求的新品种已成为促进我国木薯产业发展壮大的重大课题。杂交育种是获得木薯新品种的主要途径，但我国大部分地区的木薯在自然条件下不开花，难以开展木薯杂交育种工作。已有研究报道木薯生长发育受到内源激素影响和外施氨基酸能诱导木薯开花和早开花[3-4]，但目前对木薯花芽分化过程中内源激素和氨基酸生理变化的了解甚少。因此，分析木薯花芽分化植株与花芽未分化植株内源激素和氨基酸含量的差异，对木薯成花机理研究及花期调控具有重要意义。【前人研究进展】花芽分化是植物进入生殖生长的标志，叶芽在转变为花芽过程中其形态会发生改变，生理生化方面也发生复杂变化。从营养生长到生殖生长的过渡是被子植物生长过程中的主要变化阶段，激素在这一过程中发挥着重要作用[5]。段九菊等[6]研究表明，高玉米素核苷(ZRs)含量和高脱落酸(ABA)/赤霉素(GAs)、ZRs/GAs、ZRs/IAA及低GAs含量有利于凤梨丹尼斯完成花芽分化。蔡坤秀等[7]研究发现，叶底红叶片内源激素中生长素(IAA)、赤霉素3(GA3)、玉米素核苷(ZR)和ABA与花芽分化密切相关，高水平的ABA/IAA、ZR/IAA和ZR/GA3有利于花芽分化。氨基酸是构成蛋白质的基本单位，也是植物体内重要的生物活性物质[8]，其合成与代谢是植物体内重要的生理生化过程。刘孝仲等[9]研究报道，仅依靠不同激素间的平衡不能诱导花原基形成，花原基形成需要大量氨基酸参与。孙文全和褚孟源[10]研究显示，花芽生理分化可能同样需要大量氨基酸。Jackson和Sweet[11]研究指出，提高植物体内氨基酸含量有利于花芽形成。马青枝和李秉真[12]研究认为，在苹果梨生理分化期加强肥水管理，可为氨基酸积累提供物质基础，有利于花芽分化。可见，内源激素水平和氨基酸状况对植物花芽分化具有重要影响。【本研究切入点】花芽分化期是木薯成花转变的关键时期，但目前关于内源激素及氨基酸对木薯花芽分化响应的研究未见报道。【拟解决的关键问题】以木薯品种新选048花芽分化始期的植株与未进入花芽分化的植株为样本，采集两种植株的茎、叶和芽进行内源激素和氨基酸靶向代谢物检测，对比分析其差异性，为木薯成花的生理机理研究及花期调控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为木薯品种新选048(ManihotesculentaCrantz cv. Xinxuan No.048)花芽分化始期的植株和花芽未分化的健康植株，取其芽(即花芽和叶芽)、叶(靠近顶芽的第5片完全展开叶)和茎(靠近顶芽第5～7片完全展开叶间的茎段)各约5 g，3次重复，快速用液氮速冻后置于带干冰的泡沫箱内，带回室内存放于-80 ℃超低温冰箱中备用。

1.2 试验方法

1.2.1 内源激素含量测定 样品提取：从-80 ℃冰箱中取茎、叶和芽样品各约100.0 mg，分别加入氧化锆珠、1.5 mL提取液(甲醇∶水∶甲酸=7.9∶2.0∶0.1，再加入少量抗氧化剂二乙基二硫代氨基甲酸钠)；破碎机破碎2 min后用超声仪超声约30 min(注意破碎机管支架提前预冷，超声仪中加入冰袋)；4 ℃浸提过夜，取上清备用。

样品纯化：依次用4.0 mL甲醇、2.0 mL 0.1 mol/L氨水溶液活化小柱，样品经真空浓缩后加入0.1 mol/L氨水溶液定容至2.0 mL，过MAX小柱；依次用2.0 mL 0.1 mol/L氨水溶液、2.0 mL 0.1 mol/L氨水60%甲醇溶液淋洗后，加入2.5 mL 1.25 mol/L FA、70%甲醇溶液和1.0 mL甲醇溶解，稀释5倍上机。

测定指标及方法：采用液相色谱—质谱联用法(LC-MS)测定生长素(IAA)、脱落酸(、油菜素内酯(BR)、赤霉素1(GA1)、GA3、赤霉素4(GA4)、赤霉素7(GA7)、玉米素核苷、反式玉米素核苷(TZR)、水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)、茉莉酸甲酯(JA-Me)、茉莉酸亮氨酸(JA-Leu)、腺嘌呤(Adenine)和腺苷(Adenosine)等15种内源激素含量。色谱条件：采用Waters超高效液相系统，采用Waters HSS T3(50×2.1 mm，1.8 μm)液相色谱柱，进样量为2.0 μL，流动相A为0.1%甲酸-水溶液，流动相B为0.1%甲酸-乙腈。质谱条件：采用美国Thermo公司的Q exactive高分辨质谱检测系统，优化的质谱分析条件为鞘气40、辅助气10、离子喷雾电压-2800 V、温度350 ℃、离子传输管温度320 ℃。

1.2.2 氨基酸含量测定 样品提取：从-80 ℃冰箱中取出茎、叶和芽样品，在液氮下研磨；然后精密称量100.0 mg，用500.0 μL 0.1 mol/L盐酸涡旋溶解，37 ℃摇床孵育1 h，12 000 r/min离心10 min，取上清备用。样品衍生化：取10.0 μL样品注入清洁的样品衍生管底部，加70 μL缓冲液涡旋混匀，移取20 μL衍生试剂溶液边涡旋边加入样品管中，衍生后用封口膜封口，55 ℃加热10 min，冷却至室温后转移至干净样品瓶中。

测定指标及方法：采用超高效液相色谱法测定D-α-氨基正丁酸(RABA)、γ-氨基丁酸(GABA)、半胱氨酸(CysH)、胱氨酸(Cys)、苯丙氨酸(Phe)、丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、甲硫氨酸(Met)、精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)、酪氨酸(Tyr)、亮氨酸(Leu)、脯氨酸(Pro)、色氨酸(Trp)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、天冬氨酸(Asp)、天冬酰胺(Asn)、缬氨酸(Val)、异亮氨酸(ILE)和组氨酸(His)等23种氨基酸含量。色谱条件：色谱柱为ACCQ-TAG TMULTRA C18 1.7 μm 2.1 ×100 mm，流速0.7 μL/min，柱温50 ℃，流动相A为AccQ·TagtmUltra Eluent A Concentrate，流动相B为AccQ·TagtmUltra Eluent B，依次按0 min、B 0%，0.29 min、B 0.5%，5.49 min、B 9.1%，7.49 min、B 21.2%，7.79 min、B 59.6%，8.39 min、B 59.6%，8.48 min、B 0%，9.25 min、B 0%和13.0 min、B 0%进行梯度洗脱后，在波长为260 nm的UV-VIS检测器下进行检测。

1.3 统计分析

采用Excel 2003和SPSS 19.0对试验数据进行统计和差异性分析，采用R4.0.5进行Pearson相关分析。

2 结果与分析

2.1 木薯花芽分化株与花芽未分化株内源激素含量的差异

2.1.1 茎内源激素含量的差异 由表1可知，花芽分化株木薯茎的GA4、GA7、ZR、TZR、SA、Adenine和Adenosine含量极显著高于花芽未分化株(P<0.01，下同)，GA1、JA和JA-Leu含量极显著低于花芽未分化株，IAA和BR含量显著低于花芽未分化株(P<0.05，下同)，而ABA、GA3和JA-Me含量间差异不显著(P>0.05，下同)。其中，花芽分化株茎的Adenosine含量与花芽未分化株差异最明显，达285.00倍，其次依次为Adenine、ZR、JA、GA4和SA含量，与花芽未分化株差异依次达90.33、48.80、5.80、4.10和3.59倍。可见，木薯从营养生长到花芽分化，茎部的大部分种类内源激素(12/15)含量发生了显著或极显著变化。

2.1.2 叶片内源激素含量的差异 由表1可知，花芽分化株木薯叶的IAA和ABA含量极显著低于花芽未分化株，TZR、JA和JA-Leu含量极显著高于花芽未分化株，SA含量显著高于花芽未分化株，而BR、GA1、GA3、GA4、GA7、ZR、JA-Me、Adenine和Adenosine含量间差异不显著。其中，花芽分化株叶的TZR含量与花芽未分化株差异最明显，为12.09倍，其次分别为JA-Leu和JA含量，与花芽末分化株的差异分别达6.38和5.85倍。可见，木薯从营养生长到花芽分化，叶片只有少部分种类内源激素(6/15)含量发生了显著或极显著改变。

2.1.3 芽内源激素含量的差异 由表1可知，花芽分化株芽的GA3和JA含量显著高于花芽未分化株，ZR、SA、JA-Me和JA-Leu含量极显著高于花芽未分化株，其余芽的内源激素含量与花芽未分化株差异不显著。其中，花芽分化株芽的ZR含量与花芽未分化株差异最明显，达19.58倍，其次为JA-Me和JA-Leu含量，分别是花芽未分化株的6.17和6.15倍。可见，木薯从营养生长到花芽分化，芽部只有少部分内源激素(6/15)含量发生了显著或极显著变化。

表1 花芽分化株与花芽未分化株木薯的内源激素含量对比

综上所述，花芽分化株和花芽未分化株木薯地上部内源激素含量的差异主要发生在茎部，说明茎内源激素含量的改变对木薯花芽分化发挥关键的调控作用，其中，GA4、GA7、ZR、TZR、SA、Adenine和Adenosine的累积对木薯花芽分化具有促进作用，IAA、BR和GA1的累积则抑制木薯花芽分化。

2.2 木薯花芽分化株与花芽未分化株氨基酸含量的差异

2.2.1 茎氨基酸含量的差异 由表2可知，花芽分化株木薯茎的RABA、GABA、CysH、Phe、Gly、Glu、Gln、Met、Lys、Tyr、Leu、Pro、Trp、Ser、Thr、Asp、Asn、Val、ILE和His共20种氨基酸含量均极显著高于花芽未分化株，仅Cys含量极显著低于花芽未分化株，而Ala含量间差异不显著；花芽分化株茎的Arg含量达1717.02 mg/kg，而在花芽未分化株中未检出；花芽分化株的His、Met、Gln、Asn、Thr、CysH、Tyr、Val和ILE含量与花芽未分化株差异较明显，均在6倍以上。可见，木薯从营养生长到花芽分化，茎部大部分种类氨基酸(21/23)含量显著或极显著增加，表明茎是木薯花芽分化时氨基酸的储藏器官。

2.2.2 叶片氨基酸含量的差异 由表2可知，花芽分化株木薯叶片的Cys和Gln含量极显著高于花芽未分化株，花芽分化株的GABA、CysH、Glu、Lys、Leu、Pro、Asp、His、Phe含量显著或极显著低于花芽未分化株，而RABA、Gly、Met、Trp、Ser、Thr、Asn、Val和ILE含量间差异不显著；花芽分化株和花芽未分化株叶片均未检出Arg和Thy；花芽分化株与花芽未分化株叶氨基酸含量差异最明显的为CysH，达3.73倍，其次为Gln、Leu和Pro，依次达3.40、2.40和2.34倍。可见，木薯从营养生长到花芽分化，叶部氨基酸含量中有部分(11/23)发生了显著或极显著变化，其中以含量降低居多。

2.2.3 芽氨基酸含量的差异 由表2可知，花芽分化株木薯芽的CysH、Gly和Asn含量显著或极显著高于花芽未分化株，GABA、Phe、Arg和Trp含量极显著低于花芽未分化株，RABA、Cys、Ala、Glu、Gln、Met、Lys、Leu、Pro、Ser、Thr、Asp、Val、ILE和His含量差异不显著，而Tyr未检出；两种植株木薯芽氨基酸含量差异较明显的是Arg和GABA，分别为2.02和1.72倍。可见，木薯从营养生长到花芽分化，芽部只有少部分种类氨基酸(7/23)含量发现显著或极显著变化。

表2 花芽分化株与花芽未分化株木薯的氨基酸含量对比

综上所述，花芽分化株和花芽未分化株木薯地上部氨基酸含量的差异主要发生在茎部，说明茎部氨基酸含量的改变对木薯的花芽分化发挥着关键作用，其中，RABA、Gly、Gln、Met、Tyr、Ser、Thr、Asn、Val和ILE的累积能促进木薯花芽分化。

2.3 木薯地上部内源激素含量与氨基酸含量的相关分析

由表3可知，IAA含量与GABA、Cys、Ala、Glu和Lys含量呈极显著正相关，与Phe、Gly、Gln、Met、Arg、Tyr、Trp、Ser、Thr、Val、ILE和His含量呈显著或极显著负相关；ABA含量与CysH、Pro和Asn含量呈极显著正相关，与Met、Arg、Tyr、ILE和His含量呈显著或极显著负相关；BR含量与RABA、Phe、Gly、Gln、Met、Arg、Tyr、Trp、Ser、Thr、Val、ILE和His含量呈显著或极显著负相关；GA1含量与CysH、Pro、Asn含量呈极显著正相关，与GABA、Cys、Glu、Arg、Lys、Tyr和Leu含量呈显著或极显著负相关；GA3含量与Phe、Gln、Met、Arg、Tyr、Trp、Thr、Val、ILE和His含量呈显著或极显著正相关，与Cys、Ala、Glu、Pro和Asp含量呈显著或极显著负相关；GA4含量与RABA、GABA、Phe、Gln、Met、Arg、Lys、Tyr、Leu、Trp、Thr、Val、ILE和His含量呈显著或极显著正相关，与Asn含量呈极显著负相关；GA7含量与RABA、GABA、Gln、Met、Arg、Lys、Tyr、Leu、Thr、Val、ILE和His含量呈显著或极显著正相关，与CysH、Pro和Asp含量呈显著或极显著负相关；ZR含量与RABA、CysH、Phe、Gly、Gln、Tyr、Pro、Trp、Ser、Thr、Asp、Asn、Val、ILE和His含量呈显著或极显著正相关，与Cys含量呈显著负相关；TZR含量与RABA、Phe、Gly、Gln、Met、Arg、Tyr、Leu、Trp、Ser、Thr、Asp、Val、ILE和His含量呈显著或极显著正相关，与Gly含量呈显著负相关；SA含量与CysH、Gly、Pro、Ser、Thr、Asp和Asn含量呈极显著正相关，与Cys含量呈极显著负相关；JA含量与Cys含量呈极显著正相关，与CysH、Phe、Gly、Tyr、Pro、Trp、Ser、Asp和Asn含量呈显著或极显著负相关；JA-Me含量与CysH、Pro和Asn含量呈极显著正相关；JA-Leu含量与Cys和Asn含量呈极显著正相关，与GABA和Leu含量呈显著负相关；Adenine和Adenosine含量与RABA、Phe、Gly、Gln、Met、Arg、Tyr、Leu、Trp、Ser、Thr、Asp、Val、ILE和His含量呈极显著正相关；Adenine含量与Cys含量呈显著负相关。可见，GA3、GA4、GA7、ZR、TZR、Adenine和Adenosine含量均与Gln、Met、Tyr、Thr、Val、ILE和His含量呈正相关关系，IAA、ABA、BR、GA1、JA、JA-Me和JA-Leu含量与Gln、Met、Tyr、Thr、Val、ILE和His含量均呈负相关关系，总体上与2.1和2.2的木薯植株地上部内源激素GA3、GA4、GA7、ZR、TZR、SA、JA-Me、Adenine和Adenosine及氨基酸RABA、Gln、Met、Tyr、Thr、Val、ILE、Gly、Ser和Asn的累积，以及内源激素IAA、BR和GA1的降解能促进木薯花芽分化的研究结果吻合。

表3 木薯内源激素含量与氨基酸含量的相关系数

3 讨 论

营养是花芽分化及花器官形成与生长的物质基础[21]，营养物质的主要来源是蛋白质，合成蛋白质的前体物质是氨基酸。因此，氨基酸在作物成花中的动态变化逐渐引起了越来越多的关注。马青枝和李秉真[12]研究报道，苹果梨花芽形态分化前均积累了一定量的氨基酸，其中的Glu含量一直处于最高水平。李利红和连艳鲜[22]研究发现，Tyinthos和金杏两种杏的花芽萌发过程中氨基酸含量呈现上升趋势。刘俊松和张上隆[23]研究表明，柑橘结果树的17种氨基酸含量及其总量均高于未结果树，说明柑橘花芽分化有赖于一定总量的氨基酸合成和积累。沈方科等[21]研究表明，四季蜜芒的游离氨基酸含量为其花芽分化提供了充足氮源。本研究结果与上述研究结果相似，木薯茎部氨基酸的累积对其花芽分化发挥着促进作用，表现在木薯从营养生长进入花芽分化阶段茎部绝大部分种类的氨基酸(21/23)含量极显著累积，而叶和芽部大部分种类的氨基酸含量变化不明显，说明茎部是木薯花芽分化时氨基酸的主要储藏器官，并能在需要时快速启动茎韧皮部的长距离运输通道，将氨基酸快速运达所需部位。其中，木薯从营养生长过渡到花芽分化的生殖生长，其茎的RABA、Gly、Gln、Met、Tyr、Ser、Thr、Asn、Val和ILE含量显著或极显著升高，尤其是Gln、Met、Thr和Asn含量升高达6倍以上，可考虑用作木薯花芽分化的氨基酸指示指标。

花芽分化受到多种因素的调节与控制。阿布都卡尤木·阿依麦提等[24]研究表明，营养物质和内源激素间相辅相成、相互促进又相互拮抗，其动态变化和平衡对枣的花芽分化发挥至关重要作用。本研究结果表明，木薯内源激素IAA、BR、GA1、GA3、GA4、GA7、ZR、TZR、Adenine和Adenosine含量与部分氨基酸(10种或10种以上)含量关系密切，其消长共同调控木薯的花芽分化进程，其中，IAA和BR含量与Gln、Met、Tyr、Thr、Val、ILE和His含量呈显著或极显著负相关，GA3、GA4、GA7、ZR、TZR、Adenine和Adenosine含量与Gln、Met、Tyr、Thr、Val、ILE和His含量呈显著或极显著正相关(除ZR含量与Met含量外)。结合内源激素和氨基酸对木薯花芽分化的响应程度及二者间的相关程度，本研究认为内源激素GA4、Adenosine和Adenine含量及氨基酸Gln、Met、Thr、Tyr、Val和ILE含量的大幅度升高是指示木薯从营养生长过渡到花芽分化生长的理想生理指标。木薯花芽分化是营养生长向生殖生长转变的转折点，其过程的一系列生理状态转变不仅取决于内源激素含量的变化，也取决于氨基酸等营养物质含量的变化，其消长共同控制木薯组织中的营养转向，从而对植株芽的分化发挥调控作用。

4 结 论

木薯从营养生长过渡到花芽分化的生殖生长，茎部的内源激素及氨基酸反应最活跃，其中，GA4、GA7、ZR、TZR、SA、Adenine、Adenosine、RABA、Gly、Gln、Met、Tyr、Ser、Thr、Asn、Val和ILE的累积，以及IAA、BR和GA1的降解，对其花芽分化发挥促进作用；GA4、Adenosine、Adenine、Gln、Met、Thr、Tyr、Val和ILE含量大幅度升高可作为指示木薯花芽分化起始的最佳生理指标。