李 敏 黄炳炽 彭家杰 胡健声 洪伟彬 莫钻兰 黄洁莹

广东省东莞市动物疫病预防控制中心，广东东莞523000

锦鲤疱疹病毒病，是由锦鲤疱疹病毒（Koi her⁃pevirus，KHV）所引起的致死率80%～100%的流行性疾病，仅感染锦鲤、鲤及其变种[1-4]。该病被我国列在《一、二、三类动物疫病病种名录》中的二类疫病，世界动物卫生组织（OIE）将其列为必须申报的疫病[5]。1998年，该病首次由德国和以色列学者发现，中国香港于2001年发生首例，随后在印度尼西亚、日本等东南亚国家相继发生，现已流行于世界各地[6-7]。

水产行标《SC/T 7212.1-2011》作为此次锦鲤疱疹病毒病病原检测能力测试的依据和实验室检测的主要方法，属于传统聚合酶链式反应（PCR），具有灵敏度高、准确率高等优点，但在实际应用中，需要TK、Sph基因PCR、电泳和产物测序，存在检测时间长、操作繁琐且易污染、不能准确定量等问题。荧光定量PCR 检测耗时短、操作简便、能定量等优点被广泛应用于病原体检测[8-10]，越来越多商品化的荧光定量PCR 试剂盒被研发出来。因此，本试验拟通过此次病原检测能力测试的样本来验证不同厂家生产的试剂盒的性能。

1 材料与方法

1.1 材 料

1）样品。样品编号为K34-1、K34-2、K34-3、K34-4，由中国检验检疫科学研究院提供，4 份样品均为鱼内脏组织匀浆上清样品，采用冻存管包装。本次试验使用的阳性标准物质由中国检验检疫科学研究院提供。

2）试剂。海洋动物组织基因组DNA 提取试剂盒（批号：S8107）、PCR MasterMix（批号：KT201-02）购自天根公司；引物（批号：211044344）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；DL1000 DNA Mark⁃er（批号：ATG1607A）购自TaKaRa；50×TAE（批号：690674223）、gelred 核酸染料（批号：BS354B）购自biosharp；琼脂糖（批号：E24567B127）购自biofroxx；3种商品化的锦鲤疱疹病毒实时荧光PCR 检测试剂盒分别来自不同生产厂家，用A（批号：200603）、B（批号：67052）、C（批号：JC0069202006）来代替。

3）仪器设备。生物安全柜、梯度PCR 仪、水平电泳系统、凝胶成像仪、荧光PCR 仪、实时荧光定量PCR仪。

1.2 方 法

1）采用本次能力测试要求的方法检测。按照中国检验检疫科学研究院下发的《能力测试作业指导书》，结合水产行业标准《鲤疱疹病毒检测方法第1 部分：锦鲤疱疹病毒》（SC/T 7212.1-2011）进行试验及鉴定。

①核酸提取。参照天根DNA 提取试剂盒的说明书提取KHV核酸。

②PCR 反应。试验所需的KHVTK基因、Sph基因所需的特异性引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，根据实际用灭菌水稀释成10 mmol/L储藏液，-20 ℃保存备用，引物序列和反应程序见表1。按PCR MasterMix 说明书标示的反应体系配制反应液，分装到0.2 mL PCR 管，分别加入相应体积的阴性对照、待检样品和阳性对照，做好记录。混匀后离心，进行PCR 扩增反应，阳性标准物质由中国检验检疫科学研究院提供。

表1 KHV PCR检测所需的引物、反应程序

③琼脂糖凝胶电泳。凝胶用1×TAE 电泳缓冲液配制0.01%的琼脂糖（含10 000*superRed 核酸染料）平板，凝固后放入水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好淹没胶面。将上述5µL PCR产物加入点样孔，使用DNA 1 000作对照。110 V 电泳约25 min，放置凝胶成像仪中观察电泳片段的数量和位置。

④核酸测序。将KHVTK基因、Sph基因PCR产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

2）商品化的锦鲤疱疹病毒实时荧光定量PCR检测。以本次参测盲样为样品，从市场上选取3家不同厂家生产的实时荧光定量PCR检测试剂盒检测（由A、B、C代替）进行试验与分析，3种试剂盒的试验成立标准、结果判定标准各不相同（详见表2）。按照各自试剂盒说明书配置荧光PCR反应体系，依次加入阴性对照、样品核酸和阳性对照，加样后及时盖紧管盖，做好标记，混匀后离心，按照各自的反应程序扩增。

表2 不同试剂盒的反应体系、反应时间、试验成立和结果判定标准

2 结果与分析

按照中国检验检疫科学研究院下发的《能力测试作业指导书》，结合水产行业标准《鲤疱疹病毒检测方法第1 部分：锦鲤疱疹病毒》（SC/T 7212.1-2011）对样品进行检测。检测结果显示：样品K34-2、K34-3 为KHV 核酸阳性，样品K34-1 和K34-4 核酸阴性，检测结果为满意。

2.1 按本次能力测试要求的方法检测的结果

如图1所示：样品K34-2、K34-3的TK、Sph基因的PCR 产物分别出现了409 bp 片段和292 bp 片段，并将PCR 产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，测序同源性比对表明：该基因序列与Genbank 登录的鲤疱疹病毒3 型T 链的全基因序列MG925491.1 有99%的同源性（表3）。样品K34-1 和K34-4 未出现DNA 片段。样品K34-1 和K34-3的TK 基因和Sph 基因根据《鲤疱疹病毒检测方法SC/7212.1-2011》综合判定：测试样品k34-2 和k34-3均为KHV阳性。

表3 PCR产物的测序结果

图1 PCR产物电泳图谱

2.2 商品化的锦鲤疱疹病毒实时荧光qPCR结果

各试验阴、阳对照符合说明书的试剂成立标准，试验均成立。试验发现：B、C试剂未检出阳性样品；A试剂的扩增曲线图中呈现2条阳性对照扩增曲线，其中，一条扩增曲线为KHV阳性对照，另一条扩增曲线为CyHV-2（鲤疱疹病毒）阳性对照，A 试剂检测出K34-2 和K34-3 这两条扩增曲线，其Ct 值分别为19.84、19.57，因此可判K34-2 和K34-3 为KHV 核酸阳性。A试剂检测的结果与能力测试结果一致（图2）。

图2 不同试剂的扩增曲线图

3 讨 论

23～25 ℃是KHV 发病的最适温度，但有研究发现：KHV 已具备在平均温度3 ℃的冰下繁殖的能力[11]且尿液是KHV的主要传播途径[2]。KHV潜伏期长、传染性强、致死率高，且缺乏对KHV有效的治疗方案和预防措施。为了加强水生动物防疫系统实验室能力建设，提升实验室对水生动物病原检测的能力，越来越多的实验室配备了荧光定量PCR 仪，具备开展荧光定量PCR 检测的条件。实时荧光定量PCR 技术由美国Applied Biosystems 公司于1996年推出，具有特异性强、灵敏度高、准确可靠、无污染、实时性好且能实现多重反应等特点[21]。随着检测技术的不断发展，许多商品化的锦鲤疱疹病毒实时荧光定量PCR 检测试剂盒已被研发。本试验选取3 种试剂盒，以此次病原检测能力测试的样本为检测对象进行试剂比对发现：3 种检测试剂的试验均成立，只有A 与能力测试结果一致。因此，选用商品化试剂盒时，试剂比对尤为重要。