张晨 左其生 邹艺琛 赵娟娟 张亚妮 李碧春

（扬州大学农业科技发展研究院 教育部农业与农产品安全国际合作联合实验室 扬州大学动物科学与技术学院，扬州 225009）

原始生殖细胞（primordial germ cell，PGC）的形成需要多种因素的参与，从遗传的角度来说，基因表达、信号传导、表观遗传修饰等都对PGC的形成具有调控作用。不仅如此，Brinster等［1］提出PGC （小鼠）具有特别的能量代谢方式——偏爱丙酮酸氧化而不能氧化葡萄糖。因此代谢变化也可能参与PGC的形成。

相比遗传和表观遗传因素的调控，代谢方式的变化对表型变化的影响更为直接和明显。研究发现能量代谢方式在不同细胞中并不相同，大多的癌细胞中［2］能量代谢方式主要以糖酵解途径为主，氧化磷酸化途径不参与癌症发生过程；而正常细胞通常以线粒体氧化磷酸化产能，而不依赖糖酵解途径［3］。在PGC细胞中也同样表现为氧化磷酸化为主的能量代谢模式［4］；在精原干细胞（spermatogonial stem cell，SSC）中，为了维持其自我更新能力，细胞通常利用糖酵解途径进行产能［5］。这种现象提示我们能量代谢模式的改变可能影响细胞的命运决定。重编程过程印证了这一猜想，体细胞的氧化磷酸化代谢转变为iPS的糖酵解依赖代谢模式是多能性获得的基础［6］。因此代谢组的重组可能是引起细胞分化的原因。然而代谢途径的变化在PGC形成中的调控研究尚不明确。

甲萘醌VK3可通过单电子还原反应，产生半醌基团；或通过双电子还原得到氢醌。通过醌的氧化还原循环可产生活性氧簇等，增加氧化还原反应［7］。研究表明，VK3可作为丙酮酸激酶PKM2的专一性抑制剂，而不抑制PKL和PKM1，有效抑制糖酵解途径［8］。然而对VK3功能的研究主要集中在对癌症的抑制效果上［9-10］，在细胞分化中的调控作用还未有研究。相反，研究表明［11-12］DASA58可靶向激活PKM2，PKM2是参与糖酵解过程的糖酵解酶，可催化合成丙酮酸和ATP，因此DASA58被认为是糖酵解途径的激活剂，在癌症发生和免疫过程的研究中较为常见，其在细胞分化中的功能还不得而知。

为了研究PGC形成机制，本研究前期建立了BMP4体外诱导模型［13］，BMP4能够通过BMP4信号促进体外鸡胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESC）向原始生殖细胞样细胞（primordial germ cell，PGCLC）的分化，而BMP4信号抑制糖酵解途径关键激活剂 GSK的功能［14］，因此推测糖酵解可能参与PGC的形成。本研究对体外诱导过程中糖酵解相关基因的表达进行检测；在添加糖酵解激活剂和抑制剂后，qRT-PCR检测了相关基因的表达及类胚体/PGC-like的形成，以期为深入研究代谢系统在PGC形成中的调控机制奠定研究基础和提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

细胞及主要试剂 新鲜受精蛋来自中国农业科学院家禽研究所试验禽场如皋黄鸡。ESCs由实验室分离所得。高糖DMEM、Knockout培养基、胎牛血清、鸡血清、丙酮酸钠购自Gibco公司（美国）；β-巯基乙醇、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、bFGF、hSCF购自Sigma（美国）；mLIF 购自millipore（德国）；BMP4购自ProSpec（以色列）、VK3购自Macklin（中国）、DASA58购自MCE（美国）。

青链霉素购自（北京）索莱宝科技有限公司；TRNzol Universal 总 RNA 提取试剂、反转录试剂盒、定量试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；DDX4购自Abcam。

ESC因子培养基：Knockout DMEM+10%胎牛血清+0.1 mmol/L β-巯基乙醇+1 mmol/L丙酮酸钠+2 mmol/L的L-谷氨酰胺+1%非必需氨基酸+1 000 IU/mL LIF+10 ng/mL bFGF+5 ng/mL SCF+1×青链霉素+2%鸡血清。

BMP4诱导培养基：高糖DMEM+1×非必需氨基酸+0.1 mmol/L β-巯基乙醇+1×青链霉素+1 mmol/L丙酮酸钠+ 10 ng/mL LIF+40 ng/mL BMP4+50 ng/mL EGF。

1.2 方法

1.2.1 ESC细胞诱导 收集0 d的种蛋，药匙法获得鸡胚胚盘，ESC因子培养基吹散成细胞悬液，经400目滤布过滤后收集细胞，接种至60 mm培养皿，差速培养12 h，收集上清，接种至24孔板，体外扩增、传代、备用［15-16］。将传至第2代的ESCs以2×105个/孔接种于24孔板中，更换培养基为BMP4诱导培养基，接种至24孔板中，培养6 d，每隔2 d添加200 μL培养基。实验分组为：BMP4组，BMP4+VK3组，BMP4+DASA58组。

1.2.2 细胞形态观察 在细胞诱导的第6天观察细胞形态，分别记录20×10和40×10倍镜下的细胞形态变化并进行拍照。利用Image J对20×10倍镜下的类胚体数量进行统计。

1.2.3 RNA提取 将收集的细胞置于1.5 mL无酶管中，加入1 mL Trizol进行裂解，用移液器吹匀细胞，在室温静置5 min。加入200 mL氯仿，盖紧盖子后，剧烈振荡15 s，室温静置2 min。冷冻离心机中4℃ 12 000×g离心15 min。小心打开管盖，缓慢吸取400 μL上清，加入等体积异丙醇，轻轻混匀，在室温静置10 min。冷冻离心机中4℃ 12 000×g离心10 min，弃去上清。加入1 mL 75%的乙醇，轻轻混匀，此时可见白色RNA沉淀。冷冻离心机中4℃ 7 500×g离心5 min，弃去上清。晾干RNA，加入20 μL无酶水溶解。置于60℃促溶10 min，获 得RNA。

1.2.4 qRT-PCR 分别收集诱导2 d、4 d和6 d的细胞，Trizol裂解后提取RNA。利用天根反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，参照天根实时荧光定量PCR试剂说明书进行定量检测目的基因的表达。引物序列参照表1。

表1 qRT-PCR引物Table 1 Primers used for qRT-PCR

1.2.5 流式细胞分析 收集诱导至6 d细胞，PBS清洗后，加入10%FBS的PBS 37℃封闭2 h，PBS清洗3次后，用一抗进行孵育，37℃孵育2 h或4℃过夜。PBS清洗3次后，用对应的二抗进行孵育，37℃孵育2 h。PBS清洗3次后，上机检测。

1.2.6 数据分析 利用SPSS统计软件建立数据库并处理数据，数据组间差异用单因素方差分析，采用LSD法进行多重比较，试验数据以P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。结果以平均值形式表示。

2 结果

2.1 鸡PGC-like细胞形成中糖酵解相关基因低 表达

在体外鸡ESC诱导形成PGC-like的不同时间点对糖酵解过程相关基因的表达进行检测，qRTPCR检测结果显示，诱导第6天时，糖酵解相关基因Pgk1的表达显著降低（P<0.05），Hk1、Pkm2、Ldha、Glut1、Pfkp和Aldoc的表达极显著降低（P<0.01）（图1）。以上结果说明在PGC-like形成过程中糖酵解过程被抑制。

图1 PGC-like形成中糖酵解相关基因的表达Fig. 1 Expression of glycolysis-related genes in the formation of PGC-like

2.2 糖酵解激活剂/抑制剂调控糖酵解过程

为研究糖酵解过程在PGC-like形成中发挥的作用，本研究将糖酵解抑制剂VK3和糖酵解激活剂DASA58加入PGC-like诱导体系中，分别在不同诱导时间点检测糖酵解相关基因的表达。qRT-PCR检测结果显示在诱导第2天时，添加VK3后，糖酵解相关基因Hk1、Pkm2、Glut1、Pfkp、Aldoc表达极显著降低（P<0.01），而添加DASA58后，Ldha和Pfkp表达显著升高（P<0.05），Hk1和Pgk1表达极显著升高（P<0.01）。而在诱导第4天时，添加VK3后，Hk1、Pkm2、Ldha、Glut1、Pfkp、Aldoc和Pgk1表达极显著降低（P<0.01）。诱导第6天时，添加DASA58后，Glut1、Pfkp和Pgk1表达极显著升高（P<0.01）（图2）。以上结果说明糖酵解抑制剂VK3和激活剂DASA58可调控糖酵解过程。

图2 体外诱导过程中糖酵解抑制剂/激活剂对糖酵解相关基因的影响Fig. 2 Effects of glycolysis inhibitors/activators on glycolysis-related genes during the induction in vitro

2.3 糖酵解途径抑制类胚体形成

本研究在BMP4诱导体系中添加VK3和DASA58，并在第6天观察其对类胚体形成的影响。细胞形态学观察显示BMP4诱导后，出现带有囊腔形态的典型类胚体特征细胞，且细胞发生聚团生长的现象；在此基础上，添加VK3后，带有囊腔形态的类胚体数量增加并大量聚团（P<0.01）；而添加DASA58后，无典型的类胚体样细胞形成（图3）。以上结果说明抑制糖酵解途径促进类胚体的形成。

图3 体外诱导过程中糖酵解抑制剂/激活剂对类胚体形成的影响Fig.3 Effect of glycolysis inhibitor/activator on embryoid body formation during the induction in vitro

2.4 糖酵解途径抑制PGC-like形成

研究表明PGC-like形成经历类胚体过程，类胚体中能表达PGC标记基因的细胞可称为PGC-like。本研究前期已证明DDX4能够作为标记PGC的特异蛋白进行流式分析。因此，在BMP4诱导过程中添加VK3和DASA58后第6天收集细胞，流式分析检测PGC-like的阳性比例，结果显示当添加VK3后，PGC-like的阳性数量显著升高（P<0.05），而添加DASA58后，阳性细胞数量显著降低（P<0.05）（图4）。以上结果说明糖酵解途径抑制体外PGC-like 的形成。

图4 体外诱导过程中糖酵解抑制剂/激活剂对PGC-like形成的影响Fig. 4 Effect of glycolysis inhibitor/activator on PGC-like formation during the induction in vitro

3 讨论

糖酵解关键酶的表达影响糖酵解效率参与生物学过程，常见的糖酵解关键酶包括HK1/2、5-甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）、6-磷酸果糖-1/2-激酶（PFK1/2）、GLUT-1和LDH-A等，这些关键酶的上调往往造成较高的糖酵解率，在癌症和重编程过程中较为常见［17-19］。糖酵解关键酶（如Pglym78/pgam2）功能的丧失对成肌细胞融合能力（果蝇和斑马鱼胚胎）也会有所影响。本研究发现与心脏发育过程中糖酵解系统的正面调控作用不同［20］，在体外鸡PGC-like形成中糖酵解基因的mRNA表达普遍下降，可能由于在干细胞中糖酵解系统具有不同的表达模式。结合Zhou等［21］发现的ES细胞的能量生产具有二价特征，会根据需要从糖酵解转换为线粒体呼吸。本研究推测体外ESC向PGC-like诱导分化过程中，以糖酵解为主要能量代谢途径的模式逐渐瓦解，细胞转化为线粒体呼吸。这一推测还需要进一步对线粒体呼吸相关指标进行检测。

研究报道，甲萘醌VK3通过激活氧化还原反应抑制糖酵解过程［22-31］。本研究发现添加VK3后，有效抑制糖酵解相关基因的表达，暗示其可能对氧化磷酸化过程起激活作用。而DASA58作为PKM2的激活剂，在本研究中未出现显著激活PKM2的结果，可能是检测时间点过晚或是40 μmol/L的工作浓度难以满足激活PKM2的需要。同时，本研究还观察到添加DASA58后，Glut1、Pfkp、Pgk1的表达有所上升，说明DASA58的加入确实影响糖酵解系统的稳态，对糖酵解途径具有一定的激活作用。

能量代谢确实影响细胞的命运决定。ESC细胞往往以糖酵解途径为主要代谢方式，因此培养液中高浓度的葡萄糖有利于ESC的增殖，而葡萄糖浓度的变化则会影响ESC的分化［32-34］。研究表明AMP激活的蛋白激酶（AMPK）激活剂AICAR能启动ATP产生的分解代谢途径，抑制小鼠类胚体的形成［35］。本研究发现体外鸡PGC-like形成中糖酵解相关基因表达降低；抑制糖酵解过程促进类胚体形成，激活糖酵解后类胚体形成减少。类胚体是PGClike形成的必经阶段，糖酵解途径对类胚体形成的调控暗示其对PGC-like的形成也有相似的调控模式。本研究通过流式分析也证明了这一点。这种能量代谢的调控模式与小鼠体内PGC形成过程氧化磷酸化升高、糖酵解降低的模式不谋而合。说明糖酵解过程不是体内外PGC形成所必需的，相反，氧化磷酸化可能在体内外PGC形成中起主导作用。然而PGC形成过程涉及多种调控因素，其中能量代谢的调控机制仍需进行深入挖掘。

4 结论

本研究发现ESC向PGC-like诱导过程抑制了糖酵解相关基因的表达。在添加VK3后糖酵解基因表达降低，促进类胚体/PGC-like的形成；而添加DASA58后，Glut1、Pfkp、Pgk1的表达升高，抑制类胚体/PGC-like的形成。本研究可为后续研究体内外PGC形成中能量代谢调控模式提供参考和理论。