沈聪 刘爽 王春霞 严雪梅 代金霞

（1. 宁夏大学生命科学学院，银川 750021；2. 宁夏环境科学研究院，银川 750004）

近几十年来，随着原油工业的迅速扩张，大量原油在开采、炼制和运输过程中的泄漏风险也成比例增加，对土壤和海洋环境构成了严重威胁［1］。仅陆地运输产生的原油泄漏就造成了约10%的土壤污染［2］。石油的主要成分具有较大毒性，污染物进入土壤后难以去除，长期污染会引起土壤生物群落结构发生改变，从而损害作物生长并导致土地生产力急剧下降［3］。污染物还会随着径流进入周围的流域和地下水，对人类健康和生态系统功能具有广泛的负面影响。切实有效地解决石油污染土壤的修复问题，己成为国内外研究的热点［4］。

目前，微生物修复作为一种环境友好、经济有效的技术，成为了有较大发展潜力和应用前景的修复技术，是当前治理石油污染土壤最为有效的途径之一［5］。向石油污染土壤中投加环境适应强、降解效能高的菌种或菌群是提高生物修复效率的主要手段［6］。因此，筛选高效石油降解菌株以研制新型土壤修复剂是微生物修复的关键。作为最大的微生物资源库，土壤也是石油降解菌的重要来源之一。迄今为止，已报道的能够降解石油的土壤微生物已有200多种，其中假单胞菌属（Pseudomonas）［7］、红球菌属（Rhodococcus）［8］、微杆菌属（Microbacte- rium）［9］、芽孢杆菌属（Bacillus）［10］、产碱杆菌属（Alcaligenes）［11］等都是常被分离筛选出的石油降解菌群。但细菌的降解能力会受到石油烃性质、菌体自身特性及降解环境的影响，由于异源细菌缺乏适应性，在新环境中添加异源细菌作为生物强化剂的修复效果并不显著［12］。因此，广泛开展从原油污染土壤的土著微生物中筛选环境适应强、降解效能高的菌种并优选其作为生物强化剂的应用，可有效地促进石油污染土壤的生物修复效率。本研究从宁夏盐池县油田开发区原油污染土壤中分离筛选石油降解菌株，结合菌株的形态、生理特征及16S rRNA序列分析对其进行初步鉴定，通过菌株的交互作用和降解特性分析，构建高效的石油降解菌群，研究其对原油污染土壤的修复效果，以期为盐池地区石油污染土壤的微生物修复提供高效菌源和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 土壤来源 供试土壤：土壤样品采集于宁夏盐池县大水坑牛毛井村采油三厂附近。共设置4个样地，每个样地按照五点取样法，去除表层土后取2 cm-10 cm处污染土壤0.5 kg左右，将每个样地的5份土样混匀装入无菌袋中带回实验室备用。

1.1.2 主要培养基 富集培养基：K2HPO40.8 g；NaH2PO40.4 g；NaCl 0.2 g；CaCl20.1 g；MgSO4·7H2O 0.2 g；NH4Cl 2.0 g；适量原油；蒸馏水1 000 mL；pH 7.0-7.2；121℃灭菌20 min。

无机盐培养基：NaCl 10.0 g；NH4Cl 0.5 g；KH2PO40.5 g；K2HPO41.0 g；MgSO4·7H2O 0.5 g；CaCl20.02 g；KCl 0.1 g；FeCl2·4H2O 0.02 g；蒸馏水1 000 mL，微量元素1 mL，pH 7.5。

分离培养基：无机盐培养基1 000 mL，原油3.0 g，琼脂18.0 g-20.0 g，121℃灭菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 石油降解菌的分离纯化和富集筛选 分离培养基筛选石油降解菌：称取10.0 g油污土壤加入到已灭菌的90 mL蒸馏水中，在28℃、150 r/min 条件下振荡培养1 h，静置30 min，将上清液梯度稀释至10-2-10-4后，各取0.1 mL涂布于分离平板上，每个梯度设置3个重复，在28℃培养箱中培养2 d-7 d，挑取单菌落在分离平板上划线纯化3-4次，直至获得单一菌落。

石油降解菌的富集筛选：称取5.0 g油污土壤加入到100 mL含1%石油的富集培养基中，28℃，150 r/min振荡培养7 d，按5%的接种量将富集液转接在含有3%石油的富集培养基中，在相同条件下培养7 d，再次按5%的接种量转接于含有5%石油的富集培养基中振荡培养7 d，进行富集驯化。将以上富集液吸取梯度稀释后涂于LB平板上，28℃培养2 d-3 d，根据菌落形态进行划线纯化，直至得到单一菌株。

1.2.2 石油降解菌的鉴定 菌株的生理生化特征测定：对纯化的菌株进行革兰氏染色、硝酸盐还原、淀粉水解、明胶实验、VP实验、甲基红实验和过氧化氢酶等生理生化特征进行测定，根据《常见细菌系统鉴定手册》［13］，结合菌体和菌落形态对菌株进行初步鉴定。

菌株的分子鉴定：将纯化后的菌株接种于LB培养液中振荡培养至对数期，取1 mL菌悬液，采用细菌基因组DNA提取试剂盒（DP302，北京天根）提取菌株的总DNA，经1%琼脂糖凝胶电泳检测合格后，用细菌16S rRNA基因通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′） 和1492R（5′-CGGTTACCTTGTTACGACTTC-3′）对菌株的16S rRNA基因进行PCR扩增。扩增结束后 PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测合格后，委托上海生工生物工程股份有限公司进行测序。测序结果利用eZtaxon网站（https：//www.ezbiocloud.net/）进行同源性搜索，获得相近的相关菌株的16S rRNA序列，对各菌株的分类地位进行分析，并将筛选获得的16S rRNA基因序列提交至GenBank数据库，获得序列登录号。

1.2.3 菌株产表面活性剂能力测定 将活化后的菌株接种到含有1%石油的无机盐培养基中，28℃，150 r/min振荡培养48 h后，将培养液于4℃，10 000 r/min离心15 min，取上清。同时，在干净的培养皿中加入20 mL蒸馏水，滴加100 μL预热至50℃的石油，静置，待水面形成均匀油膜后，取100 μL发酵上清液加于油膜中心，中心油膜被挤向四周形成排油圈，形成稳定的排油圈后测定其直径，每处理3次重复［14］。

1.2.4 菌株对原油降解率的测定 根据菌株形成排油圈的大小，挑选具备较强的产表面活性剂能力的菌株，制成OD600为1.20±0.05的菌悬液，取500 μL接种至含3%原油的无机盐培养液中，振荡培养14 d后采用重量法分别测定原油残余含量并计算降解率。以不接菌的含原油无机盐培养液为对照，每个菌株做3次重复。

降解率/%=（对照原油质量-处理原油质量）/对照原油质量×100%

1.2.5 高效石油降解菌对污染土壤的修复作用 采用滤纸片法检测菌株之间的拮抗性。选取互不拮抗且降解能力最强的2株菌，调整菌株OD600=1.00±0.05，将两个菌株按照体积比1∶1混合形成复合菌群。分别将两个单一菌及复合菌按照2%的总接菌量接种于LB培养液中，28℃，150 r/min，恒温培养一定时间后弃去上清液，菌体洗涤2次后加无菌水制成OD600为1.40±0.05的液体菌剂。将原油污染土壤自然风干后，碾碎混匀过2 mm筛，分装于规格为40 cm×27 cm×15 cm的塑料花盆中，每盆加4.0 kg。在第0天和第30天在将制好的单一菌剂和复合菌剂分别按10%的接种量接种于装有石油污染土壤的塑料盆中，搅拌均匀，以不加菌剂的土壤为对照。实验期间，各组样品土壤含水率维持在15%-20%，每3 d翻耕一次，增加土壤透气性。覆土90 d后测定污染土壤中总石油含量。

2 结果

2.1 石油降解菌的分离及其多样性

2.1.1 菌株的生理生化特征 通过对菌株进行分离和富集培养，共分离出石油降解菌25株，其中5株菌分离自含5%石油的富集培养基。在富集培养过程中，上层的原油被降解为大小不一的乳化颗粒，表明土壤中的石油降解菌能够利用高浓度的石油为碳源和能源进行生长和繁殖，产生的代谢物导致原油成分被破坏，疏水性降低，从而形成乳化颗粒。分离的菌株在LB平板上大多形成乳白色或浅黄色、湿润或干燥的菌落。生理生化特征测定结果表明，18个菌株为革兰氏阳性菌，革兰氏阴性菌有7株，多数菌株硝酸盐还原和H2O2酶反应阳性，V.P反应阴性，各菌株的特征，如表1所示。

表1 菌落形态和菌株的生理生化特征Table 1 Colony morphology and physiological and biochemical characteristics of strains

2.1.2 菌株的16S rRNA基因序列分析 通过对获得的石油降解菌的16S rRNA基因进行扩增，获得大小约为1 500 bp左右的目的片段，部分菌株的PCR电泳图，如图1所示。

图1 部分菌株16S rRNA基因扩增产物电泳图Fig. 1 16S rRNA gene electrophoresis diagram of partial strains

将所测序列与eZtaxon网站已有的模式菌株进行同源分析，结果表明分离的菌株分别隶属于12个属，多样性非常丰富。结合菌株生理生化特征进行鉴定，其中隶属于链霉菌属（Streptomyces）和假单胞菌属（Pseudomonas）的菌株分别有6株，为优势菌属；3株为红球菌属（Rhodococcus）；2株为芽孢杆菌属（Bacillus）；其余8个属各有1株，包括微杆菌属（Microbacterium）和类诺卡氏菌属（Nocardioides）等常见的石油降解菌。将菌株的16S rRNA基因序列提交至GenBank数据库，获得序列登录号（表2）。

表2 菌株16S rDNA序列比对结果及登录号Table 2 Strain 16S rDNA sequence comparison results and registration numbers

2.2 高效石油降解菌的筛选

表面活性剂有降低表面张力的作用，可使均匀铺展的石油膜发生外排作用。通过对污染土壤中的石油降解菌进行富集培养，有降解作用的菌株可以利用石油作为唯一碳源和能源进行生长繁殖，产生的代谢产物导致原油成分被破坏，疏水性降低，使得培养液上层油膜分散，在液面聚集成小油粒。通过对25株菌进行排油圈的测定发现，各菌株产表面活性剂能力差别较大，其中红球菌属3株菌S16、S18 和S25产生的排油圈显著大于其他菌株（图2），说明这些菌株具有较高的产表面活性剂能力。

图2 石油降解菌产生物表面活性剂能力Fig. 2 Ability of petroleum degrading bacteria to produce surfactant

根据排油圈大小，选择8株具备较强的产表面活性剂能力的菌株，以不加菌剂为对照，通过重量法测定菌株对原油的降解能力。结果表明，菌株对原油的降解能力各不相同，降解率在25.0%-50.0%之间，隶属于红球菌属的菌株S25和S18降解能力最强，降解率分别为50%和47.2%；Cytobacillus属菌株S19和链霉菌属菌株S10次之，降解率均为44.4%；假单胞属菌株S23降解率仅为S25菌株的一半，降解能力最小（图3）。

图3 石油降解菌对石油的降解率Fig. 3 Degradation rate of petroleumby degrading bacteria isolates

2.3 单一和复合菌剂对石油污染土壤的修复效果

通过菌株的拮抗性检测，筛选菌株S25和S18用于复合菌群构建并进行土壤修复实验。分别将两个菌株制备成单一菌剂和复合菌剂施入石油污染土壤中，覆土90 d后通过重量法测定污染土壤中总石油含量。结果表明，分离出的菌株对石油污染土壤有较强的的修复能力，其中，单一菌剂S18对油污土壤中石油的降解率为62.7%，菌株S25的降解率为75.4%，而二者制备的复合菌剂的降解效果要显著强于单一菌剂，降解率达到84.7%（图4）。

图4 高效石油降解菌对污染土壤石油的降解率Fig. 4 Degradation rate of petroleum in polluted soil by high efficiency petroleum degrading bacteria

3 讨论

石油降解菌广泛存在于在石油污染土壤中。目前已报道的能够降解石油的微生物分布于100 多个属200 多种。常见的有假单胞菌属、芽孢杆菌属、红球菌属、不动杆菌属、产碱杆菌属和节杆菌属等。杨智等［8］对玉门油田污染土壤石油降解菌多样性的研究表明，分离的石油降解菌分属于21属，假单胞菌属、红球菌属、微球菌属（Micrococcus）、寡养单胞菌属（Stenotrophomonas）、无色杆菌属（Achromobacter）和葡萄球菌属（Staphylococcus）为优势菌属；赵硕伟等［15］从胜利油田污染土壤中分离筛选出的3 株高效石油降解菌株均属于红球菌属；吴涛等［16］从黄河三角洲石油污染土壤中分离得到 1 株高效耐盐石油烃降解菌 BM38，确定为恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）。本研究从宁夏盐池县油田开发区原油污染土壤中筛选出25株石油降解菌，通过形态特征、生理生化特征和 16S rRNA基因序列分析，表明这些石油降解菌隶属于12属，常见的有链霉菌属、假单胞菌属、芽孢杆菌属、红球菌属和类诺卡氏菌属等。此外，还包括微杆菌属、类芽孢杆菌属Paenibacillus、短芽孢杆菌属Brevibacillus等石油降解菌，这与众多研究中报道石油降解菌较一致［17-18］。而白蚁菌属Isoptericola、博德特氏菌属Bordetella和纤维菌属Cellulosimicrobium等作为石油降解菌的研究目前鲜有报道。白蚁菌属目前已知有4种，部分菌株有嗜热嗜盐特性，能降解甲壳素、产生水解酶促进纸浆漂白，或具备解磷、分泌吲哚乙酸、产ACC脱氨酶等促生能力；博德特氏菌属菌株多为人类病原菌，目前也有报道从石油污染土壤中分离出博德特氏菌，对汽油或润滑油具有优良的降解性能［7，19］；纤维菌属主要局限于土壤、海洋等中温环境，目前主要从热泉、南极积雪和海洋沉积物中分离出，其降解石油的作用还有待于进一步研究。

生物表面活性剂是由微生物产生的一类集亲水基和疏水基于一体的两亲化合物，由于微生物主要在油-水界面进行石油的降解活动，生物表面活性剂能够降低石油表面张力，增加石油在水相中的分散程度，以此增大石油降解菌和石油的接触面积，极大的促进了微生物对石油的吸收降解［20-21］。因此根据产表面活性剂能力强弱筛选石油降解菌是一重要的指标。目前多用降解菌的排油圈直径来表征微生物产生物表面活性剂能力。排油圈直径越大，菌株产生表面活性剂的量越多，对石油的降解作用越强。本研究分离出的25株菌产生了不同大小的排油圈，表明这些菌株都具有产表面活性剂的能力，其中3株红球菌的排油圈直径最大，石油降解率也高于假单胞菌属和芽孢杆菌属等菌株。这与已报道的假单胞菌属和芽孢杆菌具有较强的产表面活性剂和乳化原油的能力并不一致［20］。此外，对石油降解能力的差异不仅体现在不同属细菌之间，即使是同属的菌株，降解能力也有很大差别，如红球菌属的S25和链霉菌属的S10降解率显著高于同属其他菌株。这主要是由于环境因素、微生物活性和代谢途径的差异等，使得大多数菌株只能选择性地降解石油中的某一种或几种组分。为了提高石油污染土壤的修复效果，我们结合菌株的排油圈、降解率和菌株间的交互作用等，筛选出2株红球菌构建了复合菌群并进行土壤修复实验，结果显示复合菌剂的石油降解率达到了84.7%，显著高于两个单一菌剂。复合菌剂的不同菌株对于石油中不同的烃类物质具有不同的降解能力，能够极大地促进石油的降解。曹文娟等［22］向油污土壤中投加复合菌剂和单一菌剂进行土壤修复70 d，结果表明复合菌剂的降解效率达到75.0%，两个单一菌剂的降解率分别为53.0%和52.0%。孔令姣等［23］利用两个单一菌剂和复合菌剂修复石油污染土壤70 d 后，单菌的石油降解率分别为53.8%和62.8%，而复合菌剂则高达72.8%。由于石油类化合物的复杂性，不同的微生物对石油各成分的利用率不同，因此通过构建复合菌群促进石油降解已成为石油污染土壤修复的重要途径之一。但在构建菌群时，菌株之间的交互作用是首先要考虑的因素。有研究表明，一些混合菌群的石油降解效果明显低于单菌，因为菌株之间存在着相互抑制作用［24］。王佳楠等［25］的研究认为，亲缘关系近的芽孢杆菌属种间存在着协同促进作用，因此同属微生物构建的菌群对石油的降解表现出促进效果。Gong等［26］认为属水平上一致的外源细菌能够刺激同属的内源细菌，从而促进微生物强化石油的降解效果。我们对石油污染土壤的修复效果也证实，用同属于红球菌属的菌株构建的复合菌群降解率显著高于单一菌株，表明二者之间通过协同促进作用，增强了石油污染土壤的修复效果。该菌群能否对野外石油污染场地的修复发挥积极的作用还有待于进一步研究。

4 结论

盐池油田污染土壤中石油降解菌多样性丰富，假单胞菌和链霉菌是优势菌群，红球菌属菌株降解石油的能力较强，以2株红球菌制备的复合菌剂对污染土壤的修复效果要显著强于单一菌剂，具备开发为微生物修复剂的潜能。