汪颖 陈永静 孙庆业 杨梦瑶 吴盾

（1. 安徽大学资源与环境工程学院 安徽省矿山生态修复工程实验室，合肥 230601；2. 安徽省煤田地质局勘查研究院，合肥 230088）

多 环 芳 烃（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）是一种两个或两个以上苯环相联的持久性的有机污染物（如萘、蒽、菲和芘等），工业生产和日常生活中排放的多环芳烃广泛分布在自然界中，水体、土壤和大气中都检测到多环芳烃的存在［1］。多环芳烃进入环境的主要途径包括：工业污水、废水、家庭污水、油料提取，以及制造药物、油漆、塑料和杀虫剂的工厂［2］。多环芳烃的广泛分布及其对人体健康的潜在危害引起了人们对其生物降解机制的高度关注。一般来说，随着苯环数的增加、化学结构的变化和疏水性的增强，多环芳烃的电化学稳定性、抗生物降解能力也会随之增大。稳定性和疏水性是影响多环芳烃在环境中持久性的两个主要因素［3］。萘是多环芳烃中结构最简单、分子量最小的一种有机化合物，一直作为降解多环芳烃的典型化合物［4-5］。作为最常见的一种芳香族化合物，萘能阻碍人的呼吸，具有一定的毒性。

自然界中微生物种类非常丰富，大都具有很强的分解和代谢的能力。利用能够代谢多环芳烃的微生物或酶，将其转化为毒性很小或没有毒性的物质［6］，是一种有前途的、廉价的方法用来降解或清理被多环芳烃污染的环境。微生物降解是将多环芳烃从污染环境中去除的主要途径，细菌具有不同的分解酶，这一特性使它们在其他所有微生物中脱颖而出［7-8］。常见的降解多环芳烃细菌有鞘氨醇单胞属（Sphingomonas）［9］、红球菌属（Rhodococcus）［10］、芽孢杆菌属（Bacillus）［11］、假单胞菌属（Pseudomonas）［11］和伯克氏菌属（Burkholderia）［12］等。

萘的生物降解主要有水杨酸、龙胆酸和邻苯二甲酸3种降解途径［13］，通过对关键酶及其编码基因的研究，已初步探究出萘的水杨酸和龙胆酸降解途径，如图1所示。多环芳烃环羟基化双加氧酶是多环芳烃好氧降解的第一步，双加氧酶可在苯环上添加两个氧原子，萘在其作用下可生成萘二氢二醇化合物。再经过脱氢酶、双加氧酶、异构酶等作用生成2-羟基苯丙酮酸，之后在羟基苯脱萘丙酮酸水合醛缩酶的作用下生成水杨醛。最后，水杨醛经过水杨醛脱氢酶生成水杨酸，这些是萘降解的上游步骤。在下游步骤中，水杨酸在水杨酸羟化酶作用下形成儿茶酚，经过儿茶酚1，2-双加氧酶或儿茶酚2，3-双加氧酶催化，产物最终进入三羧酸循环生成二氧化碳和水。水杨酸还可在水杨酸5-羟化酶的催化作用下生成龙胆酸，经龙胆酸1，2-双加氧酶的催化，最终生成的产物进入三羧酸循环，实现对萘的降解。参与上述反应的关键酶基因分别有多环芳烃环羟基化双加氧酶基因PAH［14］、反式-o-羟基苯脱萘丙酮酸水合醛缩酶基因HBHA［15］、水杨醛脱氢酶基因nahF［16］、水杨酸羟化酶基因nahG及其重复基因nahU［17］、水杨酸5-羟化酶基因S5H［15］、儿茶 酚1，2-双 加 氧 酶 基 因CATA［18］、儿 茶 酚2，3-双加氧酶基因C230［19］和龙胆酸1，2-双加氧酶基因GDO［20］等。

图1 萘的降解途径Fig.1 Degradation pathways for naphthalene

在煤炭开采过程中，多环芳烃主要通过粉尘进入环境。在料堆和尾矿中的材料也含有多环芳烃，这些物质会对水体、土壤和地下水造成污染。微生物可以分解土壤中和植物根际周围难以分解的有机物，有效降低环境被污染程度。萘是被美国环境保护署列为优先控制污染物的16种多环芳烃之一，也是国内外许多工业污染场地中的主要污染物。因此，从尾矿中筛选出对萘具有降解能力的微生物是十分必要的。以从尾矿中筛选出的P6-4菌株为研究对象，对P6-4菌株的生理生化特性进行研究，优化其对萘的降解条件，探讨其对萘的降解途径，旨在为利用微生物修复技术治理多环芳烃污染环境提供优良菌株资源。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株筛选、鉴定

1.1.1.1 菌株的筛选 研究中使用的P6-4菌株是从白茅（Imperata cylindrica）根际尾矿中筛选出来的一株优势菌种［21］，沾取P6-4菌株接种于50 mL的萘-无机盐液体培养基［22］中，此时培养基pH为7.0，萘的浓度为100 mg/L。在35℃、150 r/min的条件下培养7 d，待培养液浑浊后，取1 mL菌液于新鲜的 萘-无机盐液体培养基内，上述操作重复3次。最后在萘-无机盐固体培养基上反复划线，观察菌株在固体培养基上的生长情况。

1.1.1.2 菌株的鉴定 基于16S rDNA序列的测定和系统发育分析方法对菌株进行鉴定：按照Bacterial DNA Kit D3350-01试剂盒中的步骤进行细菌DNA的提取，产物保存于-20℃冰箱中。以P6-4菌株的基因组DNA为模板，利用通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1 492R（5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′）进 行 扩 增。PCR反应条件为：94℃变性7 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，32个循环；72℃延伸10 min；最后4℃保存扩增产物。对扩增产物进行回收、克隆后，交由上海华大基因完成测序，将测序反馈的碱基序列于美国国家生物技术信息中心（NCBI）上进行BLAST比对。

1.2 方法

1.2.1 生理生化研究

1.2.1.1 培养基和试剂 培养基：R2A培养基、无机盐培养基、蒙金娜培养基、PKO培养基、柠檬酸盐培养基、葡萄糖蛋白胨水培养基、牛肉膏蛋白胨淀粉培养基、CAS培养基。

试剂：3%过氧化氢溶液、Salkowski比色液、结晶紫染液、碘液、95%乙醇、蕃红染液、1%溴百里香酚蓝乙醇溶液、6%α-萘酚乙醇溶液、40%氢氧化钾溶液、CAS染液。

1.2.1.2 生理生化实验 生理生化实验步骤按细菌鉴定手册［23］和相关文献［24-27］进行。

1.2.2 降解试验设计

1.2.2.1 影响菌株降解性能因素的设计 将P6-4菌株按2%的接种量接种到50 mL以萘为唯一碳源的无机盐液体培养基中，初始降解温度为35℃，培养基pH为7.0，转速为150 r/min。依次将萘降解初始质量浓度、降解温度、降解转速、降解pH设为变量，每次设置一个变量，以不加菌的萘-无机盐液体培养基为空白对照。连续培养7 d后，用光密度法测定菌体浓度（OD600），判断菌株生长情况，每组3个平行，通过菌株生长状况剪接反应菌株降解情况，分析该菌株对萘的最佳降解条件。

1.2.2.2 菌株在最佳降解条件下降解能力的设计 萘最大吸收波长的测定：用正己烷配置80 mg/L的萘标准储备液，进行梯度稀释后，紫外分光光度计上设置波长，在200 nm-800 nm范围内进行全光谱扫描，通过谱图确定萘最大吸收波长［28-29］。

萘标准曲线的绘制：向7支25 mL的比色管中依次加入0 mL、0.25 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL和5.0 mL萘-正己烷标准储备液，正己烷定容至10 mL。用1 cm石英比色皿在萘最大吸收波长处依次测吸光度，并作吸光值与浓度的关系曲线。

生长曲线的绘制：取1 mL活化后的P6-4菌株接种到50 mL萘-无机盐液体培养基中，在最优降解条件下，振荡培养7 d，每隔24 h测一次吸光度（OD600）。以不接菌种的培养基为空白对照，绘制菌株生长曲线，设置3个平行。

降解率的测定：在连续培养完成后，取20 mL培养液，于4℃、8 000×g的条件下离心10 min。吸取10 mL上清液，用5 mL正己烷进行萃取，萃取完成后，吸取上层液体用正己烷定容至10 mL。以正己烷为空白对照，用1 cm石英比色皿在萘最大吸收波长处测其吸光值，与不接菌的培养基进行对比，得到菌株对萘的最大降解率。

1.2.2.3 菌株的萘降解途径研究 通过多环芳烃环羟基化双加氧酶基因（PAH）［14］、羟基苄基丙酮酸水合醛缩酶基因（HBHA）［15］、水杨酸羟基化酶基因（nahU）［17］、水杨酸5-羟化酶基因（S5H）［15］、儿茶酚1，2-双加氧酶基因（CATA）［18］、儿茶酚2，3-双加氧酶基因（C230）［19］及龙胆酸1，2-双加氧酶基因（GDO）［20］考察菌株的萘降解途径。7种关键酶基因的相应引物，见表1。

表1 关键酶基因引物 Table 1 Primers of key enzyme gene

2 结果

2.1 P6-4菌株的鉴定

在萘-无机盐固体培养基上，菌落呈乳白色，不透明，凸起，表面油腻。以P6-4菌株的总DNA为模板进行PCR扩增，经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，1.5%的琼脂糖凝胶电泳切胶纯化，获得长度约为1 500 bp的产物，如图2所示。BLAST比对结果表明，菌株P6-4与Inquilinus属的同源性达到99%，因此判定本研究所用菌株P6-4隶属于Inquilinus属。

图2 P6-4降解菌株的16S rDNA的PCR产物电泳图Fig.2 Electrophoretogram of 16S rDNA PCR products of P6-4 degrading strain

2.2 Inquilinus sp. P6-4菌株的的生理生化特征

对P6-4菌株进行一系列生理生化实验，菌株的部分生理生化结果如表2所示，P6-4菌株为Inquilinus属革兰氏阴性好氧菌，可在含1%-3%盐度的R2A培养基和柠檬酸盐培养基上生长，并产过氧化氢酶、IAA和铁载体，同时具有溶磷、固氮功能；该菌株不产淀粉酶，分解葡萄糖时不生成乙酰甲基甲醇。

表2 P6-4降解菌株的生理生化特征 Table 2 Physiological and biochemical characteristics of P6-4 degrading strain

2.3 各因素对Inquilinus sp. P6-4菌株降解性能的 影响

2.3.1 菌株的萘最适降解初始质量浓度的测定 本实验选取9个不同的萘初始浓度进行试验。由于萘是无机盐培养基的唯一碳源，菌株的生长离不开碳源的供给，所以培养基中萘的浓度与菌株的生长有密切关系，当不额外添加碳源时，菌株在无机盐液体培养基中均无法正常生长，那么在以萘为唯一碳源条件下，菌株的生长状况与培养基中萘的含量是紧密相关的，即生长越好，降解率就越高。可通过测定菌株的生长情况，即菌株的生长情况间接反映降解情况。由图3-A可知，在萘-无机盐液体培养基中，当萘初始质量浓度为400 mg/L，P6-4菌株能够最好的生长。因此，在后续的实验工作中萘的浓度都设为400 mg/L。

2.3.2 菌株的萘最适降解温度的测定 本实验设定了5个不同的降解温度，结果如图3-B所示。菌株在20-30℃的温度范围内，菌体的浓度随着温度的升高而变大，在30℃时测得的OD600值最大，然后在30-40℃的温度范围内，菌体浓度随着温度的升高而降低。因此将30℃定为菌株降解的最佳温度，在后续的实验工作中，都将培养温度设为30℃。

2.3.3 菌株的萘最适降解转速的测定 本实验设置了7个不同摇床转速，培养结果如图3-C所示。在转速为150 r/min时，菌株的生长量最大。因此在后续实验中，摇床的转速都设定为150 r/min。

2.3.4 菌株的萘最适降解pH的测定 本实验共设定了7个不同的pH，测定菌株在不同pH下的菌体浓度（OD600），结果如图3-D所示。菌株在pH为9.0时，OD600值最大。在酸性（pH 5）和强碱（pH 10和pH 11）条件下，P6-4菌株的生长普遍受到抑制，OD600值很低，均未超过0.4。

图3 不同因素对P6-4菌株降解萘生长的影响Fig.3 Effects of different factors on the growth of P6-4 degrading strain for degradate naphthalene

2.4 Inquilinus sp. P6-4菌株在最佳降解条件下降解率的测定

利用紫外可见分光光度计进行全光谱扫描，通过最大吸收峰可知萘的最大吸收波长为275 nm。将萘标准储备液按照梯度稀释，分别配置成浓度为0 mg/L、2 mg/L、4 mg/L、8 mg/L、12 mg/L、16 mg/L和40 mg/L的萘-正己烷标准使用液，用分光光度计在275 nm处测萘各浓度对应的吸光度。以萘各梯度标准液为x，对应的吸光值为Y，制作萘标准线Y=0.045 8x+0.011 7，标准曲线R2=0.995 4。

按2%的接种量将P6-4菌株接种到萘的初始质量浓度为400 mg/L，pH为9.0的50 mL无机盐液体培养基中，置于30℃，150 r/min的条件下连续培养7 d。每隔24 h取样检测，3个平行。设不接菌的培养基为对照组，用TU-1901双光束紫外可见分光光度计测定出的吸光值（OD600）表示菌株的生长量，绘制菌株的生长曲线，结果见图4。由图4可知，第1天为生长迟缓期，第2天到第6天为对数增长期，第7天是稳定期。

图4 P6-4降解菌株的生长曲线Fig.4 Growth curve of P6-4 degrading strain

在连续培养结束后，用正己烷萃取培养基中的萘，结合萘浓度标准曲线，可知菌株对萘的最大降解率为93.22%。

2.5 Inquilinus sp. P6-4菌株的萘降解途径

从3种萘降解途径中选取7种萘降解途径中关键酶基因，对7种关键酶基因进行PCR扩增，扩增条带都清晰可见，扩增结果如图5所示，之后将扩增产物进行克隆送测。由测序结果可以判断，Inquilinus sp. P6-4菌株可以通过水杨酸和龙胆酸两种降解途径完成对萘的降解。

图5 关键酶基因的PCR扩增电泳图Fig.5 PCR amplified electrophoretic map of key enzyme genes

3 讨论

经鉴定本研究使用的P6-4菌株隶属于Inquilinus属。迄今，Inquilinus属仅有两个确定的种，分别为Inquilinus limosus和Inquilinus ginsengisoli。Inquilinus limosus由Coenye等［30］从囊性纤维化患者的呼吸分泌物中分离得到的革兰氏阴性严格需氧菌；Jung等［31］从韩国人参地土壤里筛选Inquilinus属的另一个菌种，命名为 Inquilinus ginsengisoli。目前，关于该属的已有研究多集中在其囊性纤维化潜在致病性和抗药性［30-34］，对多环芳烃降解方面的研究非常少。

微生物降解多环芳烃受诸多环境因素影响，如底物浓度、培养温度、转速、pH等［35］。本研究中，当萘初始质量浓度为400 mg/L时，菌株的生长量最大，随着底物浓度增加，菌株的生长量反而降低。Abarian等［36］研究也发现当培养基中萘的浓度过高时，细菌的生长会受到明显抑制。相关研究还发现在菌株培养过程中，若培养基中萘的含量过高，微生物的生物降解能力明显减弱，降解率与萘浓度呈负相关，说明高浓度的萘对菌株的生长有明显的抑制作用，甚至还会产生毒害作用，威胁微生物的 生存［37-38］。

细菌的生长和对萘的利用率也会随降解温度的变化而有明显的变化［39］。本研究发现，在培养温度为30℃时，P6-4菌株测得的生长量最大，但当培养温度为40℃时，菌株几乎不生长。相关研究也发现温度菌株降解萘具有较大的影响，其主要通过影响降解酶活性和微生物的生长繁殖来调节微生物对外源物质的降解吸收［40-41］。培养基中氧气的含量会对菌株生长和有机污染物的降解产生影响［38］。转速越大，培养基的溶氧量就越大。通过之前的实验得知该菌株为严格好氧菌，那么在一定范围内，随着培养基中溶氧量的增多，菌株对萘的降解率也会越大［42］。本研究在转速为0-150 r/min范围内，符合上述规律。但是当转速大于150 r/min时，菌株的生长量并不理想，可能是因为过高的转速使降解菌与瓶壁产生较大摩擦，细胞受到机械损伤，不利于菌株的生长［43］。微生物的生长繁殖以及参与的许多生化反应都需要在具有合适pH的培养基中进行，因此，培养基的pH也是影响菌株生长的一个重要因素［38］。在培养完成后，测得培养基中pH由9.0降至7.51，这可能是因为萘在降解过程中会生成小分子的有机酸类的中间产物，与碱性体系中和，使培养基中的pH有所下降［44］。相关研究表明，细菌在中性或碱性条件下对萘的降解效果更好，而在强酸强碱条件下，菌株的生长和降解能力普遍受到抑制［45-46］。

已知3种萘的生物降解途径中，水杨酸降解途径的主要代表菌株是 Pseudomonas［47］，龙胆酸降解途径的主要代表菌是 Ralstonia U2［48］，Abo-State等［49］用GC-MS分析萘降解中间产物发现邻苯二甲酸的存在。nahU基因、CATA基因、C230基因是水杨酸降解途径代表功能基因［50-52］，S5H基因、GDO基因是龙胆酸降解途径代表功能基因［53-54］。本研究发现P6-4菌株含有nahU、CATA、C230基因，同时含有S5H、GDO基因，可推测P6-4菌株对萘的降解存在水杨酸和龙胆酸两种途径，是否存在其他降解途径有待进一步探讨。

4 结论

（1）P6-4菌株为Inquilinus属，为革兰氏阴性好氧菌。（2）1%-3%盐度、过氧化氢酶、IAA、有机磷和无机磷溶解、固氮、产铁载体、柠檬酸盐利用试验结果均为阳性，甲基红试验和淀粉酶试验结果都是阴性。（3）P6-4菌株萘最佳降解条件为：萘初始质量浓度400 mg/L、30℃、150 r/min、pH 9.0。在最佳降解条件下，P6-4菌株对萘的降解率为93.22%。（4）P6-4菌 株 含 有PAH、HBHA、nahU、S5H、CATA、C230和GDO基因，推测该菌株可通过水杨酸和龙胆酸两种降解途径完成对萘的降解。