廖兆民 蔡俊，2，3 林建国 杜馨 王常高

（1. 湖北工业大学生物工程与食品学院，武汉 430068；2. 湖北工业大学生物工程与食品学院工业微生物湖北省重点实验室，武汉 430068； 3. 湖北工业大学生物工程与食品学院发酵工程教育部重点实验室，武汉 430068）

葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，E.C.1.1.3.4，GOD）是一种非常重要的黄素糖蛋白，属于氧化还原酶，在有氧条件下能专一催化β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸和H2O2［1］。GOD的应用十分广泛，在医药行业，GOD常应用于生物传感器和固定化酶［2］。GOD的反应产物过氧化氢在食品领域可作为抗菌剂和氧化剂［3］，葡萄糖酸也可以作为色素稳定剂、酸化剂和螯合剂等［4］。另外，饲料中添加GOD能促进仔猪的生长和发育［5］。

葡萄糖氧化酶广泛分布于动植物和微生物体内，但目前工业上生产葡萄糖氧化酶的主要菌株为点青霉和黑曲霉［6］。霉菌GOD具有广谱应用的特点，能让GOD在更高温度和更长时间内保持稳定，从而提高经济效益［7］。尽管已经有许多成功的研究通过使用遗传修饰和其他方法来优化霉菌GOD的产生，但是不同霉菌GOD积累的机制尚不完全清楚，且霉菌发酵生产GOD的过程中存在产生真菌毒素、发酵副产物较多等不利于后期分离GOD的缺点［8］。

异源表达重组GOD能有效解决以上问题［9］。特别是以毕赤酵母为宿主细胞构建工程菌，具有蛋白表达量高、发酵成本低和便于分离纯化等优点，并且可以选择含醇氧化酶（alcohol oxidase，AOX）强启动子的质粒进行表达载体构建［10］，同时重组酵母细胞可进行高密度连续补料发酵，有效控制外源基因的表达［11］。

本研究通过多序列比对设计简并引物，从黑曲霉中克隆得到GOD，并将其构建在pPICZαA载体上，转化至毕赤酵母GS115，实现了黑曲霉GOD的异源表达；以重组酵母为研究对象，系统优化诱导温度、pH、摇床转速和甲醇浓度等，实现了重组GOD的高效表达；在30 L发酵罐中高密度发酵放大试验，通过共表达His4，采用DO-STAT的甲醇流加策略高密度发酵，进一步实现了葡萄糖氧化酶的高效表达，为葡萄糖氧化酶的工业化生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒 黑曲霉（Aspergillus niger）菌株由湖北工业大学生物工程与食品学院微生物制剂研究团队保藏。大肠杆菌（Escherichia coli）Top10菌株购自天根生化科技有限公司。毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115由武汉轻工大学生物与制药工程学院杨江科教授馈赠。毕赤酵母表达载体pPICZαA购自淼灵生物科技有限公司。

1.1.2 主要试剂 限制性核酸内切酶Kpn I、Not I、Pme I为NEB公司产品；葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶、邻联茴香胺、牛血清白蛋白购自Sigma公司；真菌提取试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司；高保真DNA聚合酶、DNA Marker、蛋白Marker，质粒提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒、DNA片段纯化试剂盒等购于TaKaRa公司；pGM-Simple-T Fast克隆试剂盒购于天根生化科技有限公司；其他分析纯试剂购自国药集团；PCR扩增引物由南京金斯瑞公司合成。

1.1.3 培养基 黑曲霉的培养用PDA培养基。大肠杆菌的培养和转化用LB培养基和低盐LB培养基。酵母的培养、转化和蛋白的诱导产生用YPD、BMGY、BMMY等培养基。分批发酵用BSM培养基。

培养基组分成分（1 L）：PDA：马铃薯200 g和葡萄糖20 g。LB：胰蛋白胨10 g、酵母粉5 g和NaCl 10 g。低盐LB：胰蛋白胨10 g、酵母粉5 g和NaCl 5 g。YPD：蛋白胨20 g、酵母粉10 g和葡萄糖20 g。BMGY：蛋白胨20 g、酵母粉10 g、pH 6.0磷酸钾缓冲液100 mmol/L、YNB 13.4 g、甘油10 g和生物素 400 μg。BMMY：蛋白胨20 g、酵母粉10 g、pH 6.0磷酸钾缓冲液100 mmol/L、YNB 13.4 g、甲醇5 g和生物素400 μg。BSM：80% H3PO426.7 mL、CaSO40.93 g、K2SO418.2 g、MgSO4·7H2O 14.9 g、KOH 4.13 g、甘油40 g和PTM1 4.35 mL。

补料培养基：含12 mL/L PTM1的50%（W/W）甘油和2 g/L L-组氨酸。诱导培养基：含12 mL/L PTM1的甲醇。

1.2 方法

1.2.1 黑曲霉全基因组的提取 按照索莱宝科技有限公司真菌基因组提取试剂盒方法提取黑曲霉基因组DNA。

1.2.2 简并引物的设计 在NCBI数据库中下载多个有活性的黑曲霉葡萄糖氧化酶基因序列，13个NCBI序 列 号 分 别 为：AJ294936.1、AY803992.1、 DQ661005.1、DQ836361.1、EU532181.1、EU532182.1、FJ979866.1、HQ269422.1、J05242.1、JX105360.1、KC333175.1、KJ774107.1和X16061.1。通过分析其氨基酸序列设计简并引物，其5′端引物序列Z1为：5′-ATGCARACTCTKKTTGTGAG-3′，其3′端 引 物 序列Z2为：5′-TCACTGCATRGAAGCATAAT-3′。

1.2.3 葡萄糖氧化酶基因的扩增 简并引物以黑曲霉全基因组DNA为模板进行PCR。反应体系为 50 μL：10×PCR buffer（含Mg2+）5.0 μL、Z1（10 μmol/L） 1.5 μL、Z2（10 μmol/L）1.5 μL、dNTP（2.5 mmol/L）4.0 μL、模板DNA 1.0 μL、rTaq酶 1 μL和ddH2O 36 μL。PCR反应条件为94℃ 5 min；94℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 4 min，共30个循环；72℃ 10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶回收试剂盒回收。将回收产物与T载体连接，对重组质粒进行测序。

1.2.4 GOD基因重组表达载体的构建 为了确保分泌表达的GOD的N端带有天然的氨基酸残基，在上游引物5′端引入了表达载体pPICZαA的α-factor信号肽中Xho I酶切位点序列（下划线部分）和Kex 2信号肽酶切位点序列（斜体部分），并去掉GOD ORF中的信号肽序列，下游引物5′端引入了Not I酶切位点序列（下划线部分）。引物序列为：GOD-F：5′-CCCTCGAGAAAAGAAGCAATGGCATCGA AGC-3′，GOD-R：5′-TTGCGGCCGCCTGCATGGAAGC TAAT-3′，PCR反应体系和条件同上。PCR产物经纯化回收后用限制性核酸内切酶Xho I和Not I双酶切，与同样双酶切后的表达载体pPICZαA进行连接，转化到E.coli Top10。酶切鉴定阳性克隆，并送至北京擎科生物有限公司进行测序。

1.2.5 毕赤酵母的转化及摇瓶水平诱导培养 将重组质粒pPICZαA-GOD经Pme I酶切线性化，用DNA片段纯化试剂盒回收至高纯度的DNA。将5-10 μg线性化的pPICZαA-GOD质粒电击转化至80 μL毕赤酵母GS115感受态细胞，然后将转化细胞涂布于含100 μg/mL Zeocin的YPD平板上，30℃避光静置培养2-3 d，用无菌牙签挑取阳性转化子依次点种到含有500、1 000和2 000 μg/mL Zeocin的YPD平板上，30℃避光静置培养2-3 d，观察酵母转化子的生长情况，逐级筛选含有多拷贝目的基因的重组酵母菌株。挑选6株含多拷贝目的基因的重组酵母菌株转接至YPD液体培养基（50 mL培养基/250 mL三角瓶）中，于30℃、220 r/min条件下振荡培养24 h。将发酵液按1%的接种量接种到BMGY液体培养基中（25 mL培养基/250 mL三角瓶中），于30℃、220 r/min条件下振荡培养16-18 h，OD600=4-6，离心收集全部菌体，用BMMY液体培养基（50 mL培养基/500 mL三角瓶中）重悬菌体，于30℃、220 r/min条件下振荡培养96 h，每24 h补加发酵液体积0.5%的甲醇，将GOD表达量最高的转化子命名为GS115/pPICZαAGOD。

1.2.6 葡萄糖氧化酶活力测定 采用邻联茴香胺分光光度法［12］。在7 mL离心管中，加入邻联茴香胺缓冲溶液2.5 mL，18%葡萄糖溶液0.3 mL，100 U/mg辣根过氧化酶溶液0.1 mL，混匀，37℃预热3 min，分别加入0.4、0.8、1.2、1.6、2.0和2.4 U/mL葡萄糖氧化酶标准液，37℃反应3 min，加入2 mL 2 mol/L硫酸终止反应，于540 nm测定吸光度值绘制标准曲线。发酵上清液经稀释后测定540 nm处的吸光值，根据标准曲线公式，计算发酵上清液葡萄糖氧化酶活力。酶活力定义为：在温度为37℃，pH为6.0的磷酸钠缓冲溶液的反应条件下，每分钟将1 μmol/L的葡萄糖催化氧化为葡萄糖酸和过氧化氢所需要的GOD的量为一个GOD的活力单位。

1.2.7 共表达载体pPIC9k的转化 由于重组酵母为组氨酸缺陷型菌株，将pPIC9k经BspE I酶切线性化后电转至重组酵母GS115/pPICZαA-GOD，挑取阳性转化子命名为GS115/pPICZαA-GOD/His4在摇瓶水平进行诱导表达，培养条件同1.2.5。

1.2.8 摇瓶发酵条件的优化 为了探究摇瓶中重组毕赤酵母产GOD最佳条件，通过对诱导过程中的温度、pH、甲醇体积分数和摇床转速等4个因素进行了优化。挑取酶活最高的多拷贝酵母转化子转接至YPD培养基中，于30℃、220 r/min条件下振荡培养24 h。将发酵液按1%的接种量接种到BMGY液体培养基中，于30℃、220 r/min条件下振荡培养16-18 h，OD600=2-6，离心收集全部菌体，用BMMY液体培养基重悬菌体，于30℃、220 r/min条件下振荡培养96 h，每24 h补加发酵液体积0.5%的甲醇。诱导温度分别设置为15℃、20℃、25℃、30℃和35℃；pH分别设置为4、5、6、7和8；甲醇体积分数分别设置为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%；摇床转速分别设置为160、190、220、250和 280 r/min。诱导96 h后测定OD600和酶活来确定最佳诱导条件。

1.2.9 GS115/pPICZαA-GOD的高密度发酵 选取摇床水平上酶活最高的转化子，研究其在30 L发酵罐中的发酵产酶过程。挑取平板上的单菌落接种于YPD培养基培养24 h，按3%接种量转接于BMGY培养基（100 mL培养基/500 mL三角瓶中）至OD600≈10接种于含10 L BSM培养基（含2 g/L组氨酸）的30 L发酵罐，接种量为10%。诱导前用浓氨水控制pH 5.0，培养温度控制在30℃。发酵过程分为3个阶段，第一阶段为甘油分批阶段，酵母细胞消耗底水培养基积累菌体。底水培养基中甘油耗尽时（DO值陡升）进入甘油流加阶段，开始流加50%甘油和2 g/L组氨酸，至生物量达到约180-220 g/L，停止流加甘油和组氨酸，1 h后发酵液中甘油耗尽（溶氧值DO陡升）进入诱导阶段，开始流加甲醇，每12 h取样测定发酵上清液酶活和细胞湿重，并进行SDS-PAGE，考马斯亮蓝R-250染色，脱色液（乙醇150 mL、冰醋酸50 mL和水800 mL）脱色。1.2.10 GS115/pPICZαA-GOD/His4的高密度发酵 按3%接种量转接于BMGY培养基（100 mL培养基/ 500 mL三角瓶中）至OD600≈10接种于含10 L BSM培养基的30 L发酵罐，接种量为10%。诱导前用浓氨水控制pH 5.0，培养温度控制在30℃。底水培养基中甘油耗尽时开始流加50%甘油至23 h，停止流加甘油，饥饿培养1 h开始流加甲醇，甲醇流加方式采用低甲醇高溶氧的DO-STAT流加策略，通过降低甲醇流加速度使溶氧维持在10%左右，每12 h取样测定发酵上清液酶活和细胞湿重。

2 结果

2.1 多序列对比和黑曲霉GOD的克隆分析

多序列比对结果如图1，以黑曲霉全基因组DNA为模板（图2），简并引物Z1和Z2进行PCR扩增（图3）。经测序发现，该GODDNA长1 818 bp，GC含量为58%，无内含子，编码606个氨基酸。通过同源分析，与黑曲霉Z-25的GOD（GenBank登录号：FJ979866.1）有100%的核酸序列相似性。去除信号肽的GOD的PCR扩增结果见图4。

图1 部分黑曲霉来源的葡萄糖氧化酶氨基酸序列比对Fig.1 Alignment of glucose oxidase amino acid sequences from partial A. niger

图2 黑曲霉全基因组的琼脂糖凝胶电泳Fig.2 Agarose gel electrophoresis of whole genome extraction from Aspergillus niger

图3 简并引物Z1、Z2的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳Fig. 3 Agarose gel electrophoresis of PCR products of degenerate primers Z1 and Z2

图4 葡萄糖氧化酶的PCR扩增Fig.4 PCR amplification of glucose oxidase

2.2 酵母表达载体的构建与鉴定

将重组质粒pPICZαA-GOD（图5-A）转化至感受态细胞大肠杆菌Top10，并在含Zeocin的低盐LB平板上筛选阳性菌落。提取阳性菌落质粒，经Xho I和Not I双酶切后，得到约3.5和1.8 kb的2个DNA片段，亦与预期大小相符（图5-B）。重组质粒测序结果显示去除信号肽的GOD已正确插入到pPICZαA载体α-因子信号肽序列的下游，表明含黑曲霉GOD的毕赤酵母表达载体pPICZαA-GOD构建成功。

图5 重组质粒pPICZαA-GOD构建及双酶切鉴定Fig.5 Construction of recombinant plasmid pPICZαAGOD and identification by double restriction endonuclease digestion

2.3 多拷贝转化子的筛选

根据黑曲霉GOD基因序列的限制性酶切图谱，选择限制性内切酶Pme I对重组质粒pPICZαAGOD进行线性化（图6），迁移速度较慢的为线性化的pPICZαA-GOD片段。同时，用Pme I对空载体pPICZαA进行线性化处理，作为后续试验的阴性对照。将线性化的重组质粒pPICZαA-GOD和空质粒pPICZαA电击转化至毕赤酵母GS115感受态。在YPD平板生长3 d后，用无菌牙签挑取单菌落依次点种在含有Zeocin浓度分别为500、1 000和2 000 μg/mL的YPD平板上。2 d后，酵母阳性转化子在YPD抗性梯度平板上的生长情况如图7所示，挑取6株在含Zeocin 2 000 μg/mL的YPD平板上生长较好的重组酵母单菌落，进行下一步的诱导表达。

图6 pPICZαA-GOD和pPICZαA线性化产物的琼脂糖凝胶电泳Fig.6 Agarose gel electrophoresis of the linearized products of pPICZαA-GOD and pPICZαA

图7 酵母转化子的高浓度zeocin抗性筛选Fig.7 Screening of high concentration zeocin resistance of yeast transformants

2.4 GOD在毕赤酵母GS115中的表达

将上述6株重组酵母菌分别命名为A1、A2、A3、A4、A5和A6，在BMMY培养基中进行甲醇诱导表达，每24 h取样测定发酵上清液中葡萄糖氧化酶活力。图8为6株重组酵母菌诱导培养96 h的产酶曲线图。随着诱导时间的延长，发酵上清液中葡萄糖氧化酶活力不断增加。其中，重组酵母菌A6产葡萄糖氧化酶的能力最佳，甲醇诱导96 h时，发酵上清液中葡萄糖氧化酶的活力达到32.25 U/mL。因此，将重组酵母菌A6命名为GS115/pPICZαA-GOD，用于后续试验的研究。

图8 高zeocin抗性酵母转化子表达葡萄糖氧化酶的活力曲线Fig.8 Activity curve of glucose oxidase expressed by transformants with high zeocin resistance in yeast

通过共表达质粒pPIC9k，在重组酵母细胞中共表达His4，如图9-A重组酵母GS115/pPICZαAGOD/His4甲醇诱导96 h后，GOD表达量相比原始重组酵母提高了11%。同时，OD600相比原始重组酵母提高了65%，说明通过共表达His4补偿毕赤酵母GS115为组氨酸缺陷型菌株的不足，使得细胞密度大幅度提升从而提高了重组GOD表达量。

图9 GS115/pPICZαA-GOD与GS115/pPICZαA-GOD/His4的摇瓶水平诱导结果Fig.9 GS115/pPICZαA-GOD and GS115/pPICZαA-GOD/His4 shake flask level induction results

2.5 重组酵母产GOD的摇瓶发酵条件优化

通过对诱导温度、pH、甲醇体积分数和摇床转速等4个因素进行优化。结果表明，如图10-A，诱导温度对重组酵母生长和GOD表达量均有较大的影响。15-25℃酵母生长情况差别不大，但重组GOD表达量却有较大差异，15℃时GOD表达量为10.7 U/mL，随着诱导温度升高，生物量和表达量均上升。30℃时，GOD酶活达到最高31.05 U/mL，当温度继续升高时，GOD活性开始下降，这可能是由于毕赤酵母在高于30℃的条件下不利于蛋白质的表达。pH对诱导过程中细胞生长影响不大，当pH6时，GOD酶活最高为36.5 U/mL（图10-B）。甲醇体积分数对重组酵母产GOD的影响如图10-C，用1.0%甲醇进

行诱导时，获得的酶活最高为45.2 U/mL，但随着甲醇浓度的升高，细胞密度和酶活力显著降低。摇床通过不同转速的振荡影响培养基中的溶氧值从而影响细胞生长和目的蛋白的表达（图10-D），当摇床转速达到250 r/min时，细胞密度最大且此时重组GOD表达量最高。通过对重组酵母产GOD的发酵条件进行优化，结果表明最佳发酵条件为：在30℃、pH 6.0、250 r/min条件下诱导96 h，每24 h向发酵液中添加甲醇至终浓度为1.0%，重组GOD酶活达到50.1 U/mL，较优化前提高了55.3%。

图10 重组酵母产GOD发酵条件的优化Fig.10 Optimization of fermentation conditions for GOD production by recombinant yeast

2.6 GS115/pPICZαA-GOD的高密度发酵

如图11所示，发酵0-18 h，处于甘油分批阶段，生物量增长至103 g/L。发酵18 h时监测到DO值迅速上升，说明底水培养基中甘油耗尽，此时开始流加补料培养基，进入甘油流加阶段。该阶段重组酵母细胞不表达葡萄糖氧化酶蛋白，当生物量达到180 g/L以上时，停止流加甘油和组氨酸。24 h时发酵液中甘油耗尽（溶氧值DO陡升），生物量达到183.5 g/L，此时开始流加甲醇诱导酵母细胞表达GOD，发酵液中GOD活性逐渐增加。发酵72 h时生物量开始下降，由于重组酵母细胞为组氨酸缺陷型菌株，此时生物量下降的原因很有可能是培养基中组氨酸已耗尽，部分菌体衰老自溶。随着甲醇的持续诱导，发酵上清液中GOD活性继续增加。发酵120 h（诱导96 h）时发酵液中GOD活性达到最高307 U/mL，相比摇床水平，酶活提高了5.1倍。SDS-PAGE结果（图12）表明，发酵液中GOD蛋白表达量也在不断积累，发酵上清中GOD纯度非常高，仅含有少量的杂蛋白，有利于GOD的分离。

图12 30 L发酵罐中重组毕赤酵母表达葡萄糖氧化酶蛋白的SDS-PAGEFig.12 SDS-PAGE of glucose oxidase protein expressed in recombinant P. pastoris in 30 L bioreactor

2.7 GS115/pPICZαA-GOD/His4的高密度发酵

如图13，发酵0-18 h，处于甘油分批阶段，细胞湿重增长至138 g/L。24 h时发酵液中甘油耗尽（溶氧值DO陡升），细胞湿重达到225.5 g/L，较重组酵母GS115/pPICZαA-GOD提高了22.9%。此时开始以低甲醇流速诱导酵母细胞表达GOD，采用DO-STAT控制培养，整个诱导阶段溶氧控制10%左右，逐步提高转速和通气量。发酵108 h（诱导84 h）时细胞湿重达到最高440 g/L，相比GS115/pPICZαA-GOD提高了72.5%。发酵120 h时GOD活性达到最高461 U/mL，相比GS115/pPICZαA-GOD提高了50.2%。

图13 重组毕赤酵母GS115/pPICZαA-GOD/His4的高密度发酵曲线Fig.13 High density fermentation curve of recombinant P. pastoris GS115/pPICZαA-GOD/His4

3 讨论

葡萄糖氧化酶广泛应用于食品、医药、纺织和饲料等领域［13-16］。目前，大多数研究旨在产葡萄糖氧化酶菌株的诱变育种和产酶条件的优化，也有部分研究通过基因工程的手段异源表达重组葡萄糖氧化酶基因［6］。毕赤酵母作为甲基营养型酵母特别适合外源蛋白的表达，更易于进行基因操作，例如基因打靶、高频DNA转化、通过功能互补进行克隆、在细胞内或细胞外水平高效表达蛋白质，以及执行更高级别的真核蛋白质修饰的能力，如糖基化、二硫键形成和蛋白水解处理［17］。即使在连续和大规模的工业化发酵过程中，毕赤酵母也可以用最简单的培养基培养到非常高的细胞密度［18-19］，同时整合的载体有助于重组元件的遗传稳定性。由于毕赤酵母自身的天然蛋白分泌水平相对较低，因此重组分泌型蛋白的纯化方式也更加简单［20-21］。本研究依据已报道的多个黑曲霉葡萄糖氧化酶DNA序列设计简并引物，从黑曲霉中成功克隆出GOD，通过BLAST，与黑曲霉Z-25的葡萄糖氧化酶基因（GenBank登录号：FJ979866.1）相似性达100%。

本研究构建的毕赤酵母工程菌株GS115/pPICZαA-GOD在30℃、220 r/min条件下0.5%甲醇诱导96 h酶活可达32.25 U/mL。适宜的诱导条件是高效表达重组蛋白的必要条件，经优化得到最佳诱导条件为：在30℃、pH 6.0、250 r/min条件下诱导96 h，每24 h向发酵液中添加甲醇至终浓度为1.0%，重组GOD酶活达到50.1 U/mL，提高了55.3%。甲醇浓度为0.5%时，细胞密度最大，但酶活却不是最高，说明细胞密度越高并不一定代表蛋白表达量越高，诱导剂的浓度也是影响蛋白表达的重要因素之一。刘瑜等［22］报道在毕赤酵母SMD1168中表达黑曲霉QYW3221 GOD，甲醇诱导7 d后酶活最高达14.9 U/mL。周亚凤等［23］报道在毕赤酵母GS115中表达黑曲霉9029 GOD，经甲醇诱导3-4 d，发酵液中GOD活力达30-40 U/mL。Crognale等［24］将变换青霉P16 GOD在毕赤酵母X-33中异源表达，在3 L发酵罐中，发酵15 d后GOD活力达到50 U/mL。本研究在30 L发酵罐中诱导表达4 d，GOD酶活达到307.52 U/mL，是摇瓶水平的6.1倍，达到了目前研究中的较高水平，但由于重组酵母为组氨酸缺陷型菌株，若使用BSM培养基分批发酵则需要额外添加L-组氨酸，从工业化的角度来说，添加L-组氨酸大大增加了生产成本。

本研究通过共表达质粒pPIC9k引入His4，摇瓶水平研究表明，共表达His4使重组酵母的生物量提高了65%，GOD活力提高了11%。本研究采用“低甲醇-高溶氧”的DO-STAT流加策略在30 L发酵罐中诱导96 h，GS115/pPICZαA-GOD/His4细胞湿重达到432.5 g/L。此时发酵上清液中GOD活力达到最高，为461 U/mL，较原始重组酵母提高了50.2%。根据葡萄糖氧化酶的DNA序列推测其分子量为64 kD，郭瑶等［25］报道黑曲霉Z-25所产GOD的分子量为76 kD，与推测的分子量相比多出的部分为糖基化部分，糖基化程度为15.8%。毕赤酵母会对重组GOD进行高糖基化修饰［26］，本研究中重组GOD分子量约为90 kD，比黑曲霉Z-25所产GOD的分子量高约14%，这可能是过度糖基化造成的。GOD是一种糖蛋白，糖基化修饰是毕赤酵母中GOD正确折叠和装配的重要过程。后续研究中将通过酶工程技术，共表达凝集素伴侣加快糖基化修饰过程，这可能是促进毕赤酵母分泌表达GOD的有效策略。

4 结论

从黑曲霉中克隆获得GOD，实现了黑曲霉GOD在毕赤酵母GS115中的高效表达，最佳发酵条件为重组毕赤酵母GS115/pPICZαA-GOD在30℃、pH 6.0、250 r/min使用1.0%甲醇诱导表达，GOD表达量相比优化前提高55.3%。通过30 L发酵罐高密度发酵，相比摇瓶水平，酶活提高5.1倍，达到307.52 U/mL。首次在毕赤酵母GS115中共表达His4，并采用DOSTAT的甲醇流加策略在30 L发酵罐水平上实现了GOD的高效表达，大大提高了重组酵母细胞湿重和GOD酶活，最高酶活可达到461 U/mL，同时降低了发酵成本，避免了发酵过程中添加组氨酸。