李建兵，乔海清，刘 黎，李世全，王晓滨

（1.青岛市产品质量监督检验研究院，山东 青岛 266101；2.国家海洋精细化工及其生物制品质量监督检验中心，山东 青岛 266101；3.青岛市黄岛区检验检测中心，山东 青岛 266555）

农药是确保农业高收丰产的重要农资之一，农业生产离不开农药[1]。我国是农药生产和使用大国，也是农药出口大国。农药产品质量事关农业生产安全、农产品质量安全和生态环境安全，然而农业农村部公布的近3 年农药产品质量总体合格率为88.7%，不合格产品主要集中于有效成分不合格和隐性农药的添加[2]。农药有效成分及含量的监管面临着严峻的考验，关键在于农药中有效成分和隐性成分的准确定量测定。

各类农药及其制剂产品中有效成分的液相色谱检测方法大多选用甲醇或者甲醇水作为溶剂，可湿性粉剂在加工过程中一般会加入载体和助剂，甲基硫菌灵的测定一般用甲醇提取[3,4]，外标法具有操作简单，分析快速的优点，但在复杂组分中可能存在基质效益的影响；标准加入法能够有效消除基质干扰，但操作略为复杂，结果更加准确[5]。本文选取常见的甲基硫菌灵可湿性粉剂为研究对象，采用高效液相色谱法进行分析，采用外标法和标准加入法两种定量测定方法进行比较研究，为在以后的农药产品仲裁检验、产品复检、标准制修订时提供依据和技术支撑。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

1200 高 效 液 相 色 谱 仪（Agilent）；ML204T/02，0.1mg 电子天平（METTLER）。

甲醇（色谱纯CNW 安谱）。

标准物质：甲基硫菌灵（Dr.Ehrenstorfer）。

1.2 液相色谱条件

Thermo Hypersil Gold C18柱（250mm×4.6mm，粒径5μm），流动相甲醇∶水=60∶40，流速1.0mL·min-1，进样体积10μL，紫外检测器，检测波长269nm。

1.3 标准溶液配置

1.3.1 标准储备液 称取0.1g（精确至0.0001g）甲基硫菌灵标准物质于50mL 容量瓶中，加入甲醇溶解，并定容至刻度线，配制成2mg·mL-1的标准储备液。

1.3.2 标准中间液 准确移取5.0mL 1.3.1 标准储备液于50mL 容量瓶中，加入甲醇定容至刻度线，配制成0.2mg·mL-1的标准中间液。

1.3.3 外标法标准工作液 取1.3.1 标准储备液和

1.3.2 标准中间液用甲醇逐级稀释成0.02～0.6mg·mL-1的标准工作液。

1.4 样品前处理

共选取3 个不同厂家甲基硫菌灵可湿性粉剂产品，标称浓度为70%。

1.4.1 外标法前处理 分别称取0.1、0.143、0.2、0.4g 样品于50mL 容量瓶中，然后准确移取5.0mL于50mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度线，稀释10倍，过滤待测。

1.4.2 标准加入法前处理 分别称取0.1、0.143g 各3 组样品于50mL 容量瓶中，加入甲醇溶解定容至刻度线。准确移取5.0mL 于50mL 容量瓶中，第2、3 组样品再准确加入2.5 和5.0mL 0.2mg·mL-1标准使用液（1.3.2），用甲醇定容至刻度线。过滤待测。

2 结果与讨论

2.1 外标法标准曲线绘制

外标法配制0.02～0.6mg·mL-1的标准曲线，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标进行线性回归分析，线性回归方程为y=30916.4x+14.15。标准加入法曲线按照1.4.3 处理，以0 倍、1 倍、2 倍加标量峰面积为纵坐标，加标量为横坐标拟合曲线并进行样品检测。外标法和标准加入法曲线线性相关系数R2均大于0.99，结果表明，在所测定浓度范围内，标准曲线线性良好。

2.2 方法精密度

取其中一个70%甲基硫菌灵可湿性粉剂样品连续测定8 次，外标法和标准加入法精密度分别为0.83%和1.49%（见图1），表明外标法和标准加入法精密度良好。

图1 外标法和标准加入法精密度Fig.1 Precision of external standard method and standard addition method

2.3 基质效应

基质效应是农药测定时不可忽视的一个重要问题，采用t 检验比较外标法和标准加入法标准曲线斜率来考察甲基硫菌灵可湿性粉剂的基质效应。标准加入法与外标法斜率比较的t 值根据公式（1）计算。标准加入法与外标法斜率统计量t 值为96.24（＞t（11）0.05临界值=2.20）。统计发现，对于甲基硫菌灵可湿性粉剂，标准加入法的斜率与外标法的斜率存在显著差异（置信水平α=0.05）。标准加入法的斜率远小于外标法斜率，这表明，甲基硫菌灵可湿性粉剂的基质效应为强的抑制效应，标准加入法定量甲基硫菌灵可湿性粉剂的检测结果更可靠。

式中 t：标准加入法与外标法斜率的统计量；X：标准加入法斜率平均值；μ：外标法斜率；σX：标准加入法斜率标准差；n：标准加入法斜率测定次数。

2.4 外标法及标准加入法的检出限和定量限

以3 倍和10 倍信噪比作为外标法和标准加入法的检出限和定量限。外标法检出限和定量限分别为4mg·kg-1和14mg·kg-1，标准加入法检出限和定量限23mg·kg-1和78mg·kg-1。外标法和标准加入法的检出限和定量限差别较大可能是由于标准加入法的抑制基质效应产生的。

2.5 外标法和标准加入法的统计学分析

依照1.4 样品处理和1.2 液相色谱条件，对3 个不同厂家的产品分别用外标法和标准加入法进行了检测，3 个产品标准加入法定量结果分别为70.09%、70.11%、70.91%；外标法定量结果分别为73.34%、73.73%、74.11%。采用F 检验对标准加入法和外标法定量结果进行比较，标准加入法与外标法（p<0.001）有显著差异（见表1）。对任意两种不同定量方法测试结果的一致性采用t 检验方法进行比较，有显著差异的两种定量方法，采用异方差假设的t 检验方式。统计结果表明，标准加入法与外标法检测结果间存在显著差异（显著性水平α=0.05）；而标准加入法检测的结果更接近企业按照配方生产的甲基硫菌灵可湿性粉剂的标称浓度，间接说明标准加入法检测的结果更加准确和可靠。

表1 甲基硫菌灵可湿性粉剂两种定量方法测定结果（采用F 检验）Tab.1 F test of two different quantitative methods of thiophanate-methyl in wettable powder

表2 甲基硫菌灵可湿性粉剂两种定量方法测定结果（采用t-检验）Tab.2 t-test of two different quantitative methods of thiophanate-methyl in wettable powder

3 结论

本文利用HPLC 法对不同的70%甲基硫菌灵可湿性粉剂农药产品进行测定，通过对外标法和标准加入法分别定量分析比较，两种方法线性好，精密度高，外标法测定甲基硫菌灵可湿性粉剂时存在基质效应，F-检验和t-检验进一步证实标准加入法和外标法在测定甲基硫菌灵可湿性粉剂时存在显著差异，在实际检测中建议采用标准加入法获得更加准确可靠的结果。