刘 宸，王学清，豆智华，王 俊，李荣蓉，徐赵玉，杨 洁

（新疆大学生命科学与技术学院，新疆 乌鲁木齐 830046）

血管紧张素转化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）是通过肾素-血管紧张素系统调节血压的一种关键酶[1]，它是一种膜结合外在金属蛋白酶，主要存在于肺组织、外周血管组织和血管内皮细胞及其他种类的细胞中[2]。ACE可以使无活性的血管紧张素Ⅰ的C末端水解2 个氨基酸后转变成有活性的血管紧张素Ⅱ，血管紧张素Ⅱ可以降低血液流速，减少肾脏水分和盐的分泌，导致血管平滑肌收缩，引发高血压，同时ACE可水解血管舒缓激肽，使其失活，而血管舒缓激肽可以舒张血管，使血压降低，当舒缓激肽受到抑制而血管紧张素Ⅱ的活性增加后，就会引发高血压[3]。因此，以ACE为靶点的药物研究引起了越来越多的关注，ACE已被证明在降低高血压方面是成功的[4-5]。自1977年根据ACE底物的化学结构推测出ACE活性部位的模型并据此开发设计了第1个化学合成的ACE抑制剂卡托普利（Captopril）以来，ACE抑制剂药物在高血压治疗中的作用得到了医学界的普遍认可，但其对肾脏的毒副作用使研究者开始寻找安全性更高的ACE抑制剂[6]。天然来源的ACE抑制肽具有安全性高、毒副作用小、易吸收等特点，有着合成化学药物不可比拟的优越性，成为抗高血压药物研究的热点之一，其中食品来源的ACE抑制剂更是研究热点[7]。生物活性肽是食物蛋白质的特殊片段，对人体健康具有一定的生理功能，它们存在于完整的食物蛋白质中，可在食品加工过程中释放，如发酵、体外或体内酶水解[8-9]。

根据联合国粮农组织的统计数据，世界上约有2 900 万峰骆驼[10]。而新疆骆驼占比为全国首位，主要为准噶尔双峰驼，泌乳期长达12～14 个月，全疆双峰驼乳的年产量可达到3.2 万t[11]。由于驼乳含有丰富的生物活性肽和保护酶，其对氧化损伤、肠胃疾病、肝炎和糖尿病都具有良好的治疗作用[12]。同时由于驼乳中含有丰富的α-乳白蛋白，缺乏β-乳球蛋白，具有与母乳相似的蛋白结构，因此引起的过敏反应会大大降低[13]。目前多项研究证明，驼乳中含有丰富的ACE抑制肽，有研究者发现驼乳的全酪蛋白和β-酪蛋白经消化水解后，抗氧化活性和ACE抑制活性得到明显提高[14]。也有研究者对驼乳在不同蛋白酶水解下的产物ACE抑制活性进行比较，并分离出具有降血压功能的肽段[15-16]。同时，对比不同菌株发酵后驼乳和牛乳的活性发现，经发酵后的驼乳具有较高的抗氧化活性和ACE抑制活性，对人结直肠腺癌细胞（Caco-2）、人乳腺癌细胞（MCF-7）和人宫颈癌细胞（HELA）有较强的增殖抑制作用[17]。发酵后的驼乳对自发性高血压大鼠的降血压效果更好，其ACE抑制活性也更强[18]。同时有研究者通过质谱检测在水解后驼乳样品中发现多种具有ACE抑制活性的肽段[19]。目前国内研究大多针对牛乳或羊乳，对驼乳的ACE抑制肽活性研究报道较少。实验室前期研究发现，驼乳的确能够对高血压大鼠起到降低血压的作用，驼乳进入体内需要经过胃肠道的消化，因此本研究在体外模拟驼乳酪蛋白在体内的消化过程，检测水解液对ACE的抑制活性，对驼乳酪蛋白降血压能力进行评价。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

驼乳采自新疆乌鲁木齐市红雁池哈萨克村牧民家准噶尔双峰驼。

马尿酰-组氨酰-亮氨酸（Hip-His-Leu，HHL）标准品、ACE、Tris、甲醛、卡托普利 美国Sigma公司；马尿酸（hippuric acid，HA）标准品 日本东京化成工业株式会社；胃蛋白酶（1∶3 000）、胰蛋白酶（1∶250）上海蓝季科技发展有限公司；乙腈 美国Fisher公司；三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA） 成都市科龙化工试剂厂；氢氧化钠、盐酸、氯化钠、硼砂、硼酸（均为分析纯） 天津市福晨化学试剂厂。

1.2 仪器与设备

LC-10ATvp高效液相色谱仪（配备UV检测器（SPD-10Avp）和脱气装置（DGU-12A）） 日本岛津公司；Shimpack VP-ODS色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm） 日本岛津公司；PHS-2F精密pH计 上海精密科学仪器有限公司；3K30低温离心机 德国Sigma公司；SHB-BA15华牌循环水真空泵 河南巩义市英峪予华仪器厂；B3200S超声波清洗仪 美国Branson公司；AL104电子天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；超滤离心管（50、10、3 kDa） 美国Millipore公司；ALPHA 1-2 LD真空冷冻干燥机 德国Martin Christ公司；基质辅助激光解析电离-串联飞行时间质谱（matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF/TOF-MS）蛋白质组分析仪 美国应用生物系统公司。

1.3 方法

1.3.1 驼乳酪蛋白的制备

驼乳用4 层无菌纱布过滤除去杂质，3 500 r/min离心15 min，除去上层脂肪，反复多次离心，直至上层无脂肪为止，收集脱脂乳，备用。用1 mol/L HCl调节pH值至4.6，8 000 r/min离心10 min，沉淀部分（酪蛋白）用温蒸馏水反复冲洗3 次，冷冻干燥，备用。

1.3.2 驼乳酪蛋白的单酶水解和复合酶水解

单酶水解：采用2 种蛋白酶（胃蛋白酶和胰蛋白酶）分别水解驼乳酪蛋白。酪蛋白溶解于0.05 mol/L NaOH，底物质量浓度为5 g/100 mL，搅拌溶解，40 ℃预水浴，用1 mol/L NaOH或1 mol/L HCl分别调节至pH 2（胃蛋白酶）和pH 8（胰蛋白酶）；加入2%蛋白酶，反应过程中持续滴加NaOH或HCl维持反应体系pH值，分别水解0.5、1、2、3、4、5、6、8、10、12 h，取样，测定蛋白质水解度。反应结束后，水解液经90 ℃水浴15 min灭酶，迅速冷却到40 ℃，调节溶液pH值至4.6，冷却，4 000 r/min低温离心10 min，取上清液，调节pH值至7.0，冷冻干燥后冷藏，待分析。实验重复3 次。

复合酶水解：在底物质量浓度5 g/100 mL、酶底比（E/S）0.4、水解温度37 ℃、pH 2.0的条件下进行胃蛋白酶单酶水解，水解2 h后，90 ℃水浴15 min灭酶，冷却至37 ℃后，调节反应pH值至8，加入胰蛋白酶水解，分别在反应后0.5、1、2、3、4 h取酶解产物，90 ℃水浴15 min灭酶，迅速冷却到40 ℃，调节溶液pH值至4.6，冷却，4 000 r/min低温离心10 min，取上清液，调节pH值至7.0，冷冻干燥后冷藏，待分析。实验重复3 次。

1.3.3 蛋白质水解度测定

蛋白质水解度按式（1）计算。

式中：h为水解后每克蛋白被裂解的肽键毫摩尔数/（mmol/g）；htot为每克蛋白所含的肽键毫摩尔数（8.3 mmol/g）。

式（1）中，h按式（2）计算。

式中：ρ为底物蛋白质质量浓度/（g/mL）；c为水解液中氨基氮浓度/（mmol/mL）；c0为未水解底物溶液中氨基氮浓度/（mmol/mL）。

氨基氮浓度测定：采用甲醛滴定法，取样品溶液10 mL置于小烧杯中，加入30 mL超纯水，在搅拌状态下以精密酸度计测定pH值；用0.05 mol/L NaOH标准溶液预滴定至pH 8.2，再加入10 mL中性甲醛，1 min后用0.05 mol/L NaOH标准溶液滴定至pH 9.2，并记录消耗的NaOH标准溶液体积。

溶液中氨基氮浓度按式（3）计算。

式中：0.05为NaOH标准溶液浓度/（mol/L）；V0为空白组消耗NaOH标准溶液体积/mL；V1为样品溶液消耗NaOH标准溶液体积/mL；V2为样品溶液体积/mL。

1.3.4 ACE抑制率测定

1.3.4.1 样本制备

采用HHL方法检测ACE体外抑制率。

硼酸盐缓冲液配制：用超纯水配制含有0.3 mol/L NaCl的0.1 mol/L、pH 8.3硼酸盐缓冲液。

HHL溶液配制：将HHL溶于硼酸盐缓冲液，溶液浓度为5 mmol/L，分装成1 mL，－20 ℃保藏。

ACE溶液配制：将0.25 U ACE用含有0.3 mol/L NaCl的50 mmol/L、pH 7.5 Tris-HCl溶液溶解，溶液浓度为100 mU/mL，分装成250 μL，－20 ℃保藏。

对照组加入100 μL HHL溶液和25 μL硼酸盐缓冲液，样品组加入100 μL HHL溶液和25 μL酶解液，37 ℃水浴10 min，样品组和对照组各加入10 μL ACE溶液，37 ℃水浴30 min，4 500 r/min离心5 min，各加入100 μL 1 mol/L HCl，终止反应后的样品用0.45 μm微孔滤膜过滤，待检测。

1.3.4.2 反相高效液相色谱（reversed phase-high performance liquid chromatography，RP-HPLC）法检测

检测条件：Shim-pack VP-ODS色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相A：体积分数0.05% TFA-水溶液，流动相B：体积分数0.05% TFA-乙腈；检测波长228 nm；流速0.5 mL/min；梯度洗脱程序：0～10 min、流动相B体积分数5%～60%，10～12 min、流动相B体积分数60%，12～13 min、流动相B体积分数60%～5%，13～17 min、流动相B体积分数5%；进样量20 μL；温度25 ℃；外标法定量。

酶解产物样品用超纯水溶解至0.4 mg/mL，ACE抑制率按式（4）计算。

式中：S对照为空白对照组HA的峰面积/（mAU·S）；S样品为添加酶解液组HA的峰面积/（mAU·S）。

取HA标品，用硼酸盐缓冲液配制1 mg/mL母液，再用缓冲液稀释成0.01、0.05、0.10、0.50、0.80、1.00 mg/mL，色谱方法检测ACE抑制率，每个标准溶液平行测定3 次，取平均值，绘制标准曲线。

1.3.5 驼乳酪蛋白酶解产物的超滤分离

驼乳酪蛋白的酶解产物用超滤离心管进行50、10、3 kDa超滤分离，测定截留液的ACE抑制活性。

1.3.6 驼乳酪蛋白酶解产物与卡普里托抑制特性的比较

对比0.125、0.250、0.500、0.750、1.000 mmol/L底物（HHL）浓度下，0.4 mg/mL酪蛋白胰蛋白酶水解产物和0.02 μmol/L卡普里托对ACE的抑制活性，以Lineweaver-Burk作图法确定抑制剂对酶促反应的抑制类型，然后根据抑制类型应用作图法，根据米-曼式方程，求出抑制常数（Ki）。

1.3.7 驼乳酪蛋白酶解产物截留液的质谱检测

将3～10 kDa的截留液样品用于MALDI-TOF/TOF分析，在NCBI上查询相关蛋白信息。

1.4 数据处理

用Excel和Prism 5软件对数据进行线性关系和单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 驼乳酪蛋白水解产物中所含HA在RP-HPLC中的响应

以HA标品质量浓度（x，mg/mL）为横轴，峰面积（y）为纵轴绘制标准曲线，得到线性方程为y=6×106x＋123 872（R²=0.998 4），表明HA在0.01～1.00 mg/mL内线性关系良好，平均回收率为94.45%，相对标准偏差为3.2%，该方法的稳定性、精密度和重现性的相对标准偏差分别为1.51%、1.38%和1.03%，干扰较少、分析时间短、稳定性、精密度和重现性良好，此方法用于检测ACE抑制活性稳定可靠。

图1 HA溶液和驼乳酪蛋白水解产物的RP-HPLC响应色谱图Fig. 1 RP-HPLC chromatograms of HA and camel casein hydrolysates

HA溶液和驼乳酪蛋白水解产物中HA的RP-HPLC响应色谱图如图1所示。

2.2 驼乳酪蛋白酶解产物水解度和ACE抑制率

图2 驼乳酪蛋白酶解产物水解度和ACE抑制率随时间的变化Fig. 2 Changes in hydrolysis degree and ACE inhibition activity of camel milk casein with hydrolysis time

由图2A、2B可知，由于蛋白酶水解位点的特异性，对酪蛋白的水解能力有所不同，同一时间，2 种蛋白酶水解酪蛋白的水解度不同。胃蛋白酶的水解能力最弱，其可断裂苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸或缬氨酸等疏水性氨基酸残基的氨基端肽键，水解度小于5%，未水解底物较多，水解2 h，ACE抑制率为74.67%左右。胰蛋白酶专一性较强，只断裂赖氨酸残基或精氨酸残基的羧基参与形成的肽键，在水解4 h后，驼乳酪蛋白酶解产物水解度达到15%以上，ACE抑制率在2 h达到72.33%。2 种酶水解2 h时的ACE抑制率差异明显，水解12 h内的水解度差异明显，底物蛋白经蛋白酶水解一定时问后，反应体系中存在未水解大分子蛋白和部分水解的蛋白。

由图2C、2D可知，驼乳酪蛋白在双酶联合酶解条件下，与单酶水解相比，组合酶解后酶解产物的水解度迅速上升，均高于单酶水解的水解度。水解度的增加表明酶解产物中氨基酸含量增加，即底物蛋白在双酶水解作用下产生了更多短肽，酪蛋白在单酶水解作用一定时间后，底物中敏感肽键含量降低，由于酶作用的位点特异性使反应速率变慢，水解度变化趋向平缓，具有活性的多肽保持平衡，具有ACE抑制活性的多肽含量达到一定值不再增加，或是增加缓慢。而双酶水解酪蛋白时，由于酶作用位点不同，溶液中的大分子多肽段在酶作用下发生变化，溶解肽段含量增加，水解度升高，但ACE抑制率并不随着水解度的增加而增加，当进行双酶水解时，加入胰蛋白酶可能作用于具有活性的肽段，因而引起酶活性的下降。

2.3 驼乳酪蛋白酶解产物半抑制质量浓度（half inhibitory concentration，IC50）及超滤组分ACE抑制活性

以酶解产物质量浓度的对数值作为横坐标，ACE抑制率作为纵坐标，在质量浓度0.01～0.80 mg/mL范围内得出线性关系：y=0.330 7x＋0.996 8（R²=0.996 8），通过计算求出酪蛋白酶解产物的IC50为0.198 9 mg/mL。

图3 胰蛋白酶酶解产物不同超滤液组分的ACE抑制率Fig. 3 ACE inhibitory activity of different fractions of ultrafiltration

由图3可知，酪蛋白酶解产物经过50、10、3 kDa截留后，表现出不同的ACE抑制率，3 kDa截留液的ACE抑制活性最强。

2.4 驼乳酪蛋白酶解产物对ACE的抑制特性

表1 不同HHL浓度下水解产物中多肽及卡托普利的ACE抑制率Table 1 ACE inhibitory activity of casein peptides and captopril at different concentrations of HHL

由表1可知，卡托普利对ACE的抑制率随底物浓度的降低而增加，这是竞争性抑制的典型表现，底物的增加与抑制剂竞争与酶结合，减轻了抑制剂对酶的抑制作用。不同底物浓度条件下，水解产物中多肽的ACE抑制率无明显差异，由此可见，增加底物浓度不能消除多肽对ACE的抑制，符合非竞争性抑制剂的特点。

为研究水解产物对ACE抑制作用的特性，以Lineweaver-Burk作图法确定抑制剂对酶促反应的抑制类型，然后根据抑制类型应用作图法求得抑制常数（Ki）。

以Dixon作图法求取多肽对ACE的Ki，以抑制剂质量浓度为横坐标，以1/v为纵坐标，采用2 个底物浓度，绘制线性曲线，计算水解产物的Ki，如图4A所示，直线交点的横坐标为Ki，为0.25 mg/mL。

测定在不同底物浓度条件下，加入不同浓度的多肽、卡托普利与未加入抑制剂时的ACE抑制活性。由图4B、4C可知，代表不同底物水解物的几条直线与横轴相交，直线斜率和纵轴截距随水解产物浓度的增大而增大，可推断酶解产物对ACE的抑制为非竞争性抑制。卡托普利是典型的ACE竞争性抑制剂，在抑制剂存在时，直线斜率增大，与无抑制剂的曲线相交于纵轴。

2.5 驼乳酪蛋白酶解产物3～10 kDa截留液中的肽段

3～10 kDa截留液通过质谱检测得到的主要蛋白质和肽段如表2～3所示。

表3 驼乳酪蛋白酶解产物3～10 kDa截留液中酪蛋白肽段序列Table 3 Sequences of casein peptides in 3- 10 kDa retenate

由表2～3可知，3～10 kDa组分中含有多种乳清蛋白肽段，这可能是在酪蛋白的制备过程中，乳清蛋白共沉淀下来，分离不佳。其中乳铁蛋白含量较高，存在66 个小分子肽段，乳铁蛋白不仅是中性粒细胞的组成成分，同时有增强免疫力和抗氧化等生物功能。同时也发现了存在和氧化应激相关的101 个肽段，大部分来自谷胱甘肽硫转移酶和超氧化物歧化酶，这为驼乳具有抗氧化功能的效果提供了理论基础。同时还发现其具有多种瘦素以及和糖原合成相关的糖原合酶1型蛋白和降低血糖的胰岛素肽段共295 个，这也与驼乳能够降低脂肪堆积和起到降糖效果相对应。在来源于血红蛋白亚基β和酪蛋白前体肽段中，发现2 条多肽结构与已知具有ACE抑制活性多肽（LLVVYPWTR和VLPVPQQMVPYPQR）相似，这也为水解液的ACE抑制活性提供了理论依据。

3 结 论

驼乳原本的ACE抑制活性较低，但经过蛋白酶水解后，酪蛋白的ACE抑制活性增加，最终确定胰蛋白酶水解后的酪蛋白水解产物IC50为0.198 9 mg/mL。食物蛋白源的ACE抑制肽通常由蛋白酶在温和条件下水解蛋白质获得，由于酶作用位点特异性，酶解产物的肽链长度及肽段结构与蛋白酶的选择相关。水解液中含有ACE抑制肽和无ACE抑制活性的多肽、游离氨基酸等多种物质，这些组分在酶的作用下发生变化，过程复杂，存在多种转化方式，溶液中小分子肽段含量增加，但ACE抑制活性无明显变化，有研究者认为与酶解液中生成了IC50较低的ACE抑制肽有关。Cheung等[20]研究认为，ACE抑制肽的抑制活性主要取决于C端氨基酸，C端氨基酸为芳香族氨基酸（Tyr、Trp、Phe）和Pro时其抑制活性最强，说明酶解产物的ACE抑制活性不仅与多肽链的长度有关，也与多肽氨基酸结构有关。本研究中双酶水解酪蛋白，由于酶作用位点不同，溶液中的大分子多肽段在酶作用下发生变化，溶解肽段含量增加，水解度升高，但ACE抑制率并不随着水解度的增加而增加，当进行双酶水解时，加入胰蛋白酶可能作用于具有活性的肽段，因而引起酶活性的下降，吴建平等[21]在大豆降压肽的研制中也观察到了同样的现象。经过3～10 kDa分子截留的组分表现出较强的ACE抑制活性；也有研究者通过蛋白酶K水解驼乳酪蛋白，并将水解产物进行超滤，同样发现3 kDa的截留液具有较高的ACE抑制活性，与本研究结果一致[22]。本研究还发现驼乳酪蛋白水解产物对ACE的抑制为非竞争性抑制，反应底物HHL浓度的增加不能消除多肽对ACE的抑制，多肽的抑制常数为0.25 mg/mL。降血压药物卡托普利是ACE的竞争性抑制剂，其活性基团SH螯合ACE活性中心的Zn2＋，抑制酶的活性[23]。而目前对食源性蛋白多肽对ACE抑制类型的报道不多。有研究者提出对酶促反应的抑制作用，非竞争性抑制剂优于竞争性抑制剂[24]，这也说明驼乳具有和药物联合用药的潜力。本研究发现了LLVVYPWTR和VLPVPQQMVPYPQR 2 条可能具有ACE抑制活性的多肽。Haines等[25]在鹿茸的发酵液中发现了具有ACE抑制活性的多肽LVVYPW、LVVYPWTQ和VVYPWTQ，这与本研究肽段LLVVYPWTR具有较高的相似度，其可能通过相同的空间结构来抑制ACE活性。Chen Li等[26]用复合酶水解牛乳后发现了具有抑制作用的肽段VLPVPQ，Soleymanzadeh等[27]利用乳酸菌PTCC1899发酵驼乳后发现了β-酪蛋白抗氧化活性肽MVPYPQR，而这2 个肽段与本研究检出的属于β-酪蛋白前体的肽段VLPVPQQMVPYPQR具有极高的相似性，不同的是本研究中的肽段是前2 个肽段之间用谷氨酰胺将二者连接。同时在κ-酪蛋白的肽段中具有和ACE抑制肽的肽段IPP相同结构的肽段，但可能由于酶的不同，其肽段过长，并未彻底将肽段IPP分离开，但这也说明水解液中含有多种具有ACE抑制活性的多肽，它们各自具体的抑制活性还需要后续进行实验研究，但这些都解释了驼乳对于辅助治疗高血压方面能起到良好的作用。

总的来说，双酶水解相比单酶水解，驼乳酪蛋白水解度增加，但ACE抑制活性未随着水解度的增加而增加，这可能是第2种蛋白酶（胰蛋白酶）作用于具有活性的肽段，因而引起酶活性的下降。经水解后的酪蛋白水解物与卡托普利符合非竞争性抑制剂的特点，多肽的抑制常数为0.25 mg/mL。且水解后3～10 kDa截留物的ACE抑制活性最好，对其质谱检测发现了2 条与已知ACE抑制肽结构相似的肽段LLVVYPWTR和VLPVPQQMVPYPQR。