李玉玉，牟怡晓，张 硕，马聪慧，雷晓青，朱鸿福，张 欢，张桂杰

（1.宁夏大学农学院动物科学系，宁夏 银川 750021；2.宁夏草牧业工程技术研究中心，宁夏银川 750021；3.天津云力之星生物科技有限公司，天津 300354）

紫花苜蓿(Medicago sativa)是一种优质高产的豆科牧草，其蛋白质含量高，且含有动物所需的多种矿物质和维生素，因其优良的饲用特性，被称为“牧草之王”[1]。目前，我国苜蓿主要加工方式是干草制作，调制过程中苜蓿自然晒干较为困难，易发霉变质，且干草饲喂营养损失较大[2]。因此，将苜蓿制成青贮饲料，不仅可以延长贮存时间，还可以有效减少营养损失，提高其适口性和消化率。对于牧场来说，青贮苜蓿是可靠又经济的蛋白质饲料，提升青贮饲料品质、提高青贮饲料用量是中小型牧场降本增效的有效措施之一。因而，越来越多从事苜蓿生产的企业开始关注苜蓿青贮的调制，青贮饲料的制备也趋于机械化和自动化[3]。在国家“振兴奶业苜蓿发展行动”计划支持下，宁夏大力发展苜蓿产业，建设高产优质苜蓿示范区，使得优质苜蓿种植面积不断扩大。宁夏地区第2茬至第4茬(6月至8月)苜蓿收割期，正值雨热同期，这为调制干草带来了挑战。随着牧场对苜蓿青贮的认可度越来越高，宁夏苜蓿青贮生产空间巨大，可有效促进苜蓿产业和奶业的发展[4]。

由于紫花苜蓿刈割时水分含量较高，可溶性碳水化合物含量少，附着的乳酸菌较少，缓冲能较高，因此难以单独青贮[5]。已有研究证实[6-10]，生物添加剂如乳酸杆菌和纤维素酶等可以有效改善青贮品质。其中，纤维素酶可以降解植物细胞壁，将多糖水解为单糖，增加青贮发酵底物，产生大量乳酸和少量乙酸，降低pH，提高发酵品质[11]；研究表明，纤维素酶能够降低中性洗涤纤维浓度且对未成熟植株作用效果更强[12]；纤维素酶还可改善饲料青贮品质[13-14]。目前关于纤维素酶调控青贮品质的研究主要集中在单一纤维素酶对饲草青贮品质的影响[15-17]，为此，本研究选择青贮专用复合纤维素酶，探究其对苜蓿青贮的营养成分、发酵品质、微生物数量及有氧稳定性的影响，为提高苜蓿青贮品质和拓宽草食家畜优质饲草料来源提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1试验原料

试验选用宁夏茂盛草业公司种植的“中苜4号”紫花苜蓿，于2018年5月19 日现蕾期–始花期刈割，留茬高度7 cm。刈割后，苜蓿阴干，由Aurora 型手持式近红外光谱仪，确定水分含量下降至65%左右进行青贮。苜蓿营养成分含量分别为干物质37.40%，粗蛋白19.33%，粗脂肪1.90%，可溶性碳水化合物2.03%，中性洗涤纤维48.54%，酸性洗涤纤维37.32%，酸性洗涤木质素6.12%，纤维素31.33%，相对饲喂价值为114.65。

1.1.2试验添加剂

试验所用青贮复合纤维素酶由天津云力之星生物科技有限公司馈赠，是一种专用于苜蓿青贮的复合酶制剂，其中纤维素酶活力≥60 000 U·g−1，木聚糖酶活力≥ 2 500 U·g−1，淀粉酶活力≥ 300 000 U·g−1，β-葡聚糖酶活力≥300 000 U·g−1。

1.2 试验设计

采用单因素完全随机设计，对照组(T1组)不添加青贮专用复合纤维素酶，T2组、T3组、T4组分别添加2.5‰、5.0‰和7.5‰青贮专用复合纤维素酶，每个处理6个重复。苜蓿原料用铡刀铡成2 cm的小段，将纤维素酶均匀地拌于原料之中，装于单向气阀的青贮袋(20 cm ×30 cm)中进行真空压缩密封，密封后密度为705～725 kg·m−3，室温25℃，青贮时间60 d。

1.3 测定指标与方法

1.3.1营养成分

分别取适量液氮中苜蓿和500 g 青贮料置于冻干机中冻干，冻干后再次称量，计算干物质(dry matter,DM)经粉碎机粉碎，过0.425 mm 孔径筛，装袋置干燥处保存。粗蛋白(crude protein,CP)、粗脂肪(ether extract,EE)、可 溶 性 碳 水 化 合 物(water soluble carbohydrate,WSC)、中性洗涤纤维(neutral detergent fiber, NDF)、酸性洗涤纤维(acid detergent fiber,ADF)、酸性洗涤木质素(acid detergent lignin,ADL)、粗纤维(crude fiber,CF)含量参照《饲料分析及饲料质量检测技术》[18]进行测定。相对饲喂价值(relative feed value,RFV)计算方法为：

1.3.2发酵品质

pH测定方式：称取5 g 样品于锥形瓶中，加入45 mL 蒸馏水，振荡30 min，并使样品完全浸入水中，用封口膜封口，于4℃下保存24 h，用4层纱布过滤取上清液，使用雷磁PHS-3G 精密pH 计进行测定。

氨态氮/总氮(NH3-N/TN)采用苯酚–次氯酸钠比色法测定；乳酸(lactic acid,LA)使用试剂盒测定，试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

挥发性脂肪酸(volatile fatty acid, VFA)的测定：取滤液0.5 mL，加入等体积的8.2%偏磷酸，13 000 r·min−1离心10 min，取上清液加入内标巴豆酸，使用GCMS-TQ8040型气相色谱仪(日本岛津公司)，Rtx®-Wax 毛细管色谱柱，分析测定上清液中丙酸、乙酸及丁酸的含量。

1.3.3微生物和有氧稳定性

乳酸菌、酵母菌、霉菌数量的测定使用稀释涂布平板法，选用MRS 培养基培养乳酸菌，马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar，PDA)培养基培养酵母菌和霉菌。乳酸菌选择培养基上光滑、圆形的白色菌落进行计数，酵母菌计数选择培养基上湿润、光滑、不透明、大而厚的菌落进行计数。霉菌选择为培养基上菌丝细长、菌落疏松呈绒毛状面絮状的菌落进行计数，菌落计数单位用lg cfu·g−1表示。

有氧稳定性的测定：在发酵60 d 后打开全部发酵袋青贮，将温度记录仪(HOBO Pendant Temperature/Light，USA)放入发酵袋几何中心处，封口并在青贮袋上刺小孔，置于室温(26℃)下保存，使空气可以自由进入袋中。同时在室内不同位置放置3个温度记录仪。若青贮袋中的温度高于室温2℃，则说明青贮开始腐败变质，计算开袋至腐败变质的时间。

1.4 数据分析

使用Excel对数据预处理，再使用SPSS 23.0统计分析软件进行ANOVA 方差分析比较均值，并采用Duncan’s法进行多重比较。P<0.05为显著差异，P<0.01为极显著差异。

2 结果与分析

2.1 青贮专用复合纤维素酶对苜蓿青贮营养成分的影响

T2、T3和T4组CP含量均高于T1组，T4组的CP含量最高(表1)，显著高于T1组(P<0.05)；各组间EE 无显著性差异(P>0.05)；T3组WSC含量极显著高于其他处理组(P<0.01)；纤维素酶处理青贮中CF含量极显著低于T1组，且T3组极显著低于T2组(P<0.01)；T3组NDF含量极显著低于其他处理组(P<0.01)；T3组与T4组的ADF 含量与RFV值极显著低于或高于T1组和T2组(P<0.01)；纤维素酶处理组ADL 含量极显著高于T1组(P<0.01)，但处理组间差异不显著(P>0.05)。

表1 青贮专用复合纤维素酶对苜蓿青贮营养成分的影响Table 1 Effect of silage-specific compound cellulase on alfalfa silage nutrition components

2.2 青贮专用复合纤维素酶对苜蓿青贮发酵品质的影响

如表2所列，添加纤维素酶可极显著降低青贮pH(P<0.01)，其中T2组最低，为4.43，酶处理组间差异不显著(P>0.05)。纤维素酶处理组氨态氮含量极显著低于T1组(P<0.01)。添加纤维素酶的3个处理组中，乳酸含量随纤维素酶添加量的增加而降低，T2组与T3组均极显著高于T1组(P<0.01)，T4组与T1组差异不显著(P>0.05)。T2组和T3组的乙酸含量极显著低于T1组(P<0.01)，而T4组与T1组差异不显著。T3、T4组的丙酸含量极显著高于处理T1、T2组(P<0.01)，但T1、T2组之间丙酸含量差异不显著(P>0.05)，T3、T4组之间丙酸含量差异亦不显著(P>0.05)。丁酸含量在T3组未检测到，其余各组含量较少且各组无差异。

表2 青贮专用复合纤维素酶对苜蓿青贮发酵品质的影响Table 2 Effect of silage-specific compound cellulase on alfalfa silage fermentation quality

2.3 青贮专用复合纤维素酶对苜蓿青贮微生物的影响

如表3所列，乳酸菌、霉菌数量随开袋时间增长呈现增加趋势，酵母菌在开袋第3天数量下降，然后升高。开袋后第1天T3组乳酸菌含量显著低于其他3组(P< 0.05)；T1组中的酵母菌数量极显著高于其他3个组(P<0.01)，霉菌数量最低，为3.30 lg cfu·g−1。第3天T4组的乳酸菌数量显著高于其他3个组(P<0.05)，达7.46 lg cfu·g−1，4个处理组的霉菌数量差异不显著(P>0.05)，T2组的酵母菌数量极显著低于T1组和T3组(P<0.01)。开袋第6天T4组乳酸菌数量显著高于其他3个组(P<0.05)，T1组的酵母菌数量极显著高于其他3个组(P<0.01)，且T2组的酵母菌数量最低。

表3 不同处理组间苜蓿青贮开袋后微生物动态变化(干物质基础)Table 3 Dynamic changesbetween different treatmentson microbial populationsafter opening daysof alfalfa silage(DM basis)

2.4 青贮专用复合纤维素酶对苜蓿青贮有氧稳定性的影响

在有氧暴露后，青贮料的有氧稳定性时间表现T3组最长(53.5 h)，T1组最短(51 h)。T1和T4组有氧暴露时间显著低于T2和T3组(P< 0.05)(图1)。

图1 青贮专用复合纤维素酶对苜蓿青贮有氧稳定性的影响Figure 1 Effect of silage-specific compound cellulase on alfalfa silage aerobic stability

2.5 苜蓿青贮发酵品质V-score评分分析

采用V-score评分体系对4组青贮的品质进行综合分析(表4)。结果表明，各组的青贮饲料总体评价均为良好(> 80分)，其中T3组的得分最高。

表4 不同处理组间苜蓿青贮V-score评分Table 4 V-score of different treatmentson microbial populations

3 讨论

3.1 青贮专用复合纤维素酶对苜蓿青贮营养成分的影响

纤维素酶可以将青贮原料中的结构性糖类降解为单糖或双糖，为乳酸的生成提供可利用发酵底物，同时纤维素酶中含有氧化还原酶，可以加快氧气的消耗，为青贮提供厌氧环境，抑制腐败菌的生长[19-21]。纤维素酶属于青贮发酵促进剂，利用纤维素酶对青贮纤维素进行分解，增加可溶性碳水化合物含量，为乳酸菌活动提供能源，纤维素酶不引起蛋白质的分解，不降低粗蛋白含量[22]，这与本研究中处理组粗蛋白含量均高于对照组粗蛋白质含量的结果一致。而T3组氨态氮较高且乳酸菌含量较少，有害微生物快速生长，蛋白质的降解作用增强[23]，由此可解释添加纤维素酶的3个处理组中T3组粗蛋白含量相对最低。本研究中添加青贮专用复合纤维素酶有效降低苜蓿青贮中NDF和ADF含量，这与徐然等[14]对光叶紫花苕(Vicia villosaRoth)的研究结果一致。木质素是一种结构复杂的高分子聚合物，真菌、细菌、放线菌等微生物和其他酶类物质可以有效降解木质素，但木质素在厌氧条件下很难被降解。由于添加纤维素酶使得苜蓿青贮中氧气消耗加快，有效抑制好氧微生物和其他酶类对木质素的降解，所以在本研究中添加纤维素酶并没有起到降低木质素的作用[24-26]。T3组可溶性碳水化合物含量最高，且NDF含量显著低于其他3组，说明纤维素酶水解植物细胞壁产生的过量可溶性碳水化合物未被微生物完全利用[27]。T4组开袋第1 天乳酸菌含量高于其他3组，其他微生物含量也偏高，故T4组可溶性碳水化合物含量低于T3组。

3.2 青贮专用复合纤维素酶对苜蓿青贮发酵品质的影响

pH和氨态氮是评定青贮发酵品质的重要指标。各处理的乳酸含量均高于其他有机酸，乙酸含量高于丙酸和丁酸。因此，苜蓿青贮发酵属于乳酸发酵与醋酸发酵相结合的混合型发酵，乳酸含量高是造成青贮pH 低的主要原因[28]。当苜蓿青贮中pH 迅速降至4.7以下时，抑制了有害菌丁酸梭菌的生长，乳酸菌成为优势菌群进行繁殖，加速乳酸的积累，并产生少量的乙酸。可溶性碳水化合物的含量取决于乳酸菌的繁殖速度和酶解产糖之间的平衡，发酵过程中部分糖会转化成乙醇，使青贮具有酒香味。纤维素酶的添加增加了乳酸的产量[29]，然而，在纤维素酶一定作用范围内，过多的纤维素酶不利于乳酸菌与发酵底物的接触[13]，导致乳酸含量下降。这也是本研究中纤维素酶3个处理组乳酸含量依次下降的原因之一，这与陈鑫珠等[13]对常规水分和低水分稻草青贮品质的影响研究结果一致。

丙酸在3种有机酸中抗真菌能力较强，但酸性最弱，其抑菌作用随pH降低而增强[30]。Hristov[31]研究表明，添加纤维素酶、半纤维素酶等添加剂可以降低燕麦(Avena sativa)和普通黄耆(Astragalus propinquus)混合青贮饲料中氨态氮的生成量，这与本研究结果相反，可能是由于本研究以苜蓿为原料，青贮中蛋白含量高所引起。苜蓿青贮中丁酸梭菌可以产生丁酸，也可以分解蛋白质产生氨态氮，影响青贮气味，降低适口性，影响采食[32-34]，T3组的青贮中并未检测到丁酸，且氨态氮显著高于其他3组，是由于蛋白自身过度降解所致。

3.3 青贮专用复合纤维素酶对苜蓿青贮微生物和有氧稳定性的影响

乳酸菌是青贮中起主要发酵作用的有益微生物，可以在厌氧条件下利用碳水化合物产生乳酸。在厌氧条件下，酵母菌可以利用青贮中的糖类繁殖并产生乙醇和二氧化碳，使其具有酒香味，但酵母菌的剧烈活动会引起青贮的二次发酵，不利于贮藏[35]。本研究中，无添加组的乳酸菌含量最低，酵母菌的含量最高，添加复合纤维素酶的青贮料中酵母菌含量降低，这与侯美玲等[36]对羊草(Leymus chinense)青贮品质研究结果相同，说明纤维素酶的添加降低青贮料pH 是有效抑制了酵母菌的繁殖所致。

在青贮开袋后，由于青贮料与空气接触，导致青贮中的好氧微生物开始活跃，使得青贮料变质进程开始，其中好氧微生物利用青贮中的营养物质进行大量繁殖[37]。随着有氧暴露时间的增加，霉菌和酵母菌数量迅速上升，乳酸菌数量增长缓慢，与刘立山等[38]研究中乳酸菌数量降低的结果相反，这可能是因为好氧菌的快速繁殖消耗青贮中的氧气，使厌氧菌进行缓慢繁殖。苜蓿青贮在开袋51～53 h 后已经开始变质，说明好氧微生物的霉菌和酵母菌开始快速繁殖。较低的pH 为青贮提供了稳定的发酵环境，可以更好地抑制腐败菌的生长，使有氧稳定时间延长，而酵母菌可以利用乳酸产生酒精，并发生有氧变质[36]。添加酶制剂的3个组的有氧稳定性高于对照组，其中T3组的有氧稳定性最好；此外T2组和T3组的乳酸含量较高，乳酸具有一定的抗菌性，因此T2组和T3组的苜蓿青贮有氧稳定性显著提高。

4 结论

本研究对4组添加不同浓度青贮专用复合纤维素酶的苜蓿青贮营养成分、发酵品质、微生物和有氧稳定性等指标进行了研究，结果表明，各组苜蓿青贮品质评定均能达到良好青贮品质标准。添加复合纤维素酶降低了青贮苜蓿中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维的含量，减少了干物质损失，提高了苜蓿青贮营养价值；添加复合纤维素酶还可降低苜蓿青贮pH 和乙酸含量，提高乳酸含量和有氧稳定性，改善苜蓿青贮发酵品质。研究结果表明，4个处理组的青贮品质表现为T3组(5.0‰) >T2组(2.5‰)>T4组(7.5‰)>T1组(0)，即添加5.0‰的青贮专用复合纤维素酶青贮效果最好。